解淀粉芽胞桿菌JK3發(fā)酵優(yōu)化及抗青枯活性物質(zhì)鑒定.pdf

1、解淀粉芽胞桿菌JK3（Bacillus amyloliquefaciens JK3）是從煙草根際土壤中分離出來(lái)的有益菌株，它對(duì)引起茄科植物產(chǎn)生青枯病的青枯雷爾氏菌有明顯的抑制效果。目前，我們已經(jīng)將其制成制劑，應(yīng)用于煙草青枯病的防治。制劑中起主要作用的是芽胞，其次是該芽胞桿菌產(chǎn)生的活性物質(zhì)。本研究中，對(duì)該芽胞桿菌的發(fā)酵進(jìn)行了優(yōu)化，以增加活菌數(shù)及活性物質(zhì)的產(chǎn)量，并對(duì)其抗青枯菌活性物質(zhì)進(jìn)行了分離鑒定。
　　本研究通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)、Plac

2、kett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、爬坡實(shí)驗(yàn)及中心組合實(shí)驗(yàn)（Central Composite Design，CCD），對(duì)該株解淀粉芽胞桿菌JK3進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化。最終確定小麥粉、豆粕粉、K2HPO4的濃度分別為14.57 g/L、9.75g/L、5.46g/L時(shí)，活菌數(shù)和抑菌圈直徑均能取到較大值，預(yù)測(cè)值分別為28.63×108、1.95cm。按此配方進(jìn)行驗(yàn)證，每組重復(fù)3次，得到實(shí)際值為（26.53±3.87）×108、1.82±0.03c

3、m，預(yù)測(cè)精度為92.7％和93.3%，優(yōu)化后的培養(yǎng)基較LB分別提高了122.38%、30%。本文對(duì)溫度、初始 pH、接種量等條件進(jìn)行了優(yōu)化，得到在溫度、初始 pH、接種量分別為34℃、5、2%時(shí)活菌數(shù)達(dá)到最大；溫度、初始pH分別為31℃、8時(shí)抗青枯活性最大，接種量對(duì)抗青枯活性的影響不大。在進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)，活菌數(shù)與抗青枯菌活性之間存在一定的負(fù)效應(yīng)。考慮到發(fā)酵主要目的為提高活菌數(shù)，故此以活菌數(shù)最大的條件為發(fā)酵條件。按優(yōu)化好的發(fā)

4、酵培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件進(jìn)行3.5 L小型發(fā)酵罐發(fā)酵，活菌數(shù)及抑菌圈直徑分別為（41±7）×108、1.38±0.02 cm。
　　對(duì)抗青枯菌活性物質(zhì)的鑒定中，通過(guò)HPLC和MALDI-TOF-MS檢測(cè)以及脂肽類抗生素Surfactin與純化得到Iturin和Fengycin混合物進(jìn)行抗青枯菌活性檢測(cè)，我們初步判定活性物質(zhì)為脂肽類抗生素 Surfactin。但在進(jìn)一步確定活性物質(zhì)是否為Surfactin時(shí)，我們發(fā)現(xiàn) Surfactin基