血細胞分析儀檢測技術及臨床應用課件_1

1、血細胞分析儀檢測技術及臨床應用,血細胞分析儀檢測是臨床診斷工作中最常用的實驗方法之一40年代后期美國庫爾特先生(W.H.Coulter)發(fā)明了粒子計數(shù)技術(電阻抗法),50年代初期應用于血細胞計數(shù),血細胞分析儀檢測原理,一.電阻抗法(庫爾特原理)1.血細胞具有非傳導性質(zhì)(不良導體)2.E=I x R→脈沖信號3.脈沖信號大小與細胞體積成正比4.脈沖信號的多少代表細胞數(shù)量,細胞的三分群：各種細胞在溶血劑中，經(jīng)溶血劑中表面活性

2、劑對細胞膜表面的脂蛋白作用后而分群，由于RBC膜表面的脂蛋白含量最少而易被破壞溶解,白細胞的細胞漿漏出，僅留下核與顆粒并使細胞縮小，原來最大的單核細胞經(jīng)溶血劑作用后，體積就落在了小的淋巴和大的中性粒細胞之間，這樣就按照溶血劑作用后體積大小，將白細胞分成三群。,淋巴細胞：35-90fl; 中間細胞：90-160fl; 粒細胞>160fl依照三群細胞在白細胞體積分布的直方圖上所分布區(qū)域的面積，計算得出每群細胞的百分比，并依照白細胞計

3、數(shù)總數(shù)，求得每群細胞的絕對值。注意:各廠家的溶血劑配方不完全相同,對白細胞膜的作用程度不同,而各廠家對儀器的各類WBC區(qū)分設置也不盡相同.,RBC及相關參數(shù)的檢測RBC檢測→電阻抗原理脈沖信號高度的疊加→HCT單個脈沖信號高度的均值→MCVRBC:36—360fL區(qū)間分析RDW:儀器將不同大小的脈沖信號分別貯存在不同通道,計算出相應的體積和數(shù)目,再統(tǒng)計處理得到RDW,用RBC體積的CV或SD表示.RBC計數(shù)中WBC含量可忽

4、略不計,但在白血病或WBC異常增高時則對RBC及其相關參數(shù)有明顯影響.,PLT檢測:電阻抗原理PLT和RBC一起同時被檢測PLT體積分布:2—28fL,不同儀器的PLT直方圖 范圍不一.MPV:是PLT體積分布直方圖的產(chǎn)物MPV與PLT成非線性負相關PCT參考范圍是一不恒定參數(shù)PDW:是PLT體積分布直方圖的產(chǎn)物PLCR:＞12fL的PLT比率,浮動界標技術 1.RBC/PLT :

5、 為便于識別，在RBC/PLT通道一般把體積大于30f1的細胞計為紅細胞(RBC)，而把體積小于30f1的細胞計為血小板(PLT)。一般的血細胞分析儀，PLT和RBC的分界點是固定的(例如30f1處)，這種情況屬于固定界標。但也有例外的情況，有些公司的血細胞分析儀，可以把PLT和RBC的分界點人為地設置在5-30f1的范圍內(nèi)，在實測樣本時，儀器根據(jù)PLT和RBC的分布曲線，自動在所設定的范圍內(nèi)尋找最低點，以得到正確的PLT. RBC及相

6、關參數(shù)的結(jié)果，這就是浮動界標.,2.WBC : 當直方圖出來后，由軟件程序自動判別并尋找直方圖上三個區(qū)域的起止點（即第一個高峰起止和第二個高峰地點）作為界標線，并以此為依據(jù)進行判讀，由于設計理念的不同，稀釋液和溶血劑對細胞的作用不同于固定界標，因此，浮動界標的wbc直方圖很少有能超過350fl的橫坐標。直方圖每次的結(jié)果是不一樣的，因此界標線的位置也是不一樣，這就形成界標線的移動，就是浮動界標,Hb檢測:

7、與WBC一起被檢測SLS-HGB檢測血紅蛋白：測定原理：亞鐵血紅素中的Fe2+離子被十二烷基磺酸鈉氧化，形成SLS-HGB衍生物，在550nm波長進行比色測定。SLS-Hb法測定與ICSH的參考方法相比，具有非常高的相關性(r=0.999)。,二.血細胞檢測技術的發(fā)展（五分類）1。光散射法(Scatter): 來自激光光源的單色光束在10°--70°對細胞進行掃描,提供細胞結(jié)構(gòu)、形態(tài)的光散

8、射信息。 光散射特別具有對細胞顆粒的構(gòu)型和顆粒質(zhì)量的區(qū)別能力，從而將三種粒細胞區(qū)分。 利用高低角度光散射可同時對PLT和RBC進行計數(shù).高角(5-15°)測量RBC數(shù),檢測PLT內(nèi)容物.低角(1-3°)檢測RBC\PLT體積.,2。電導法 根據(jù)細胞壁能產(chǎn)生高頻電流的性質(zhì)采用高頻電磁探針，測量細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)、核漿比、細胞內(nèi)顆粒大小和密度。 電導法可辨別體積相同而性質(zhì)不同的

9、兩個細胞群（如；小淋巴和嗜堿）,3。射頻技術； 在測量小孔的內(nèi)外電極裝有直流和高頻兩個發(fā)射器，因此在小孔周圍產(chǎn)生直流和射頻兩種電流，直流電僅能測量細胞大小，而射頻可透入細胞內(nèi)，測量核的大小及顆粒的多少。 利用阻抗+射頻技術可將淋巴、單核、粒細胞區(qū)分。,4.過氧化物酶染色技術過氧化氫酶含量:嗜酸粒細胞＞中性粒細胞＞單核細胞. 淋巴和嗜堿粒細胞無由于酶反應陽性程度不同,通過激光束時的吸光度也就不同,加上光散射及

10、特殊溶血劑的作用可進行五分類.,5.核酸熒光染色技術利用聚次甲基熒光染色液對有核細胞的核酸(DNA/RNA)進行熒光染色。采用半導體激光流式細胞檢測，獲得WBC/DIFF散點圖并得到新的檢測參數(shù)IG和OTHER。通過對散點圖的分析，可獲得LYMPH、MONO、EOS、NEUT+BASO及NRBC和Ret的測定結(jié)果。最早的全自動網(wǎng)織紅分析儀R-1000TM，用熒光染料堿性槐黃；最新采用的是聚次甲基染料，用來進行WBC四分類、網(wǎng)織紅細胞測

11、定、有核紅細胞測定，該染料被紅色半導體激光（波長為633nm）激發(fā)后發(fā)出660nm或更高波長的紅色熒光。,該技術采用檢測三種光學信號(前向散射光、側(cè)向散射光、側(cè)向熒光)進行白細胞分類的測定。前向散射光：細胞大小信息。所采集的前向散射光信號用于對WBC/BASO的測定。側(cè)向散射光：反映細胞核及顆粒的信息(主要是顆粒的復雜性) 。所采集的側(cè)向散射光信號用于WBC/BASO和WBC/DIFF的測定。側(cè)向熒光：通過對核酸(DNA和RNA)

12、進行染色，熒光信號提示細胞核酸的信息。所采集的側(cè)向熒光信號用于WBC/DIFF 的測定。,,,,,,,三.血細胞分析檢測項目的進展1.幼稚細胞的檢測:⑴幼稚白細胞膜上的脂質(zhì)較成熟白細胞為少，使用含有能固化細胞膜和胞漿的硫化氨基酸的溶血劑，由于脂質(zhì)的成分、含量及在細胞膜上的占位不同，結(jié)合在幼稚白細胞上的硫化氨基酸較成熟白細胞為多，使胞膜和漿都固化，對溶血劑中具有溶血作用的非離子表面活性劑具有抵抗作用，加入溶血劑后，成熟白細胞被溶解，而

13、幼稚白細胞得以保存 ,通過DC檢測出幼稚細胞,⑵核酸熒光染色:根據(jù)細胞成熟度的不同可以體現(xiàn)在其熒光信號的強弱上，其白細胞分類通道除正常細胞分類外，還有兩個幼稚白細胞的定量參數(shù)： IG （幼稚粒細胞）和 Other （原始細胞 / 異常淋巴） ,激光照射后產(chǎn)生熒光信號，和側(cè)向散射光一道繪制成二維散點圖進行白細胞分類。,,利用幼稚細胞(IMI)的檢測可應用于外周血干細胞移植(PBSCT).PBSCT技術的關鍵是確定移植所需PBSC的量和采

14、集PBSC的最佳時機.在外周血幼稚或原始細胞增加的同時,伴隨著干細胞的增加,因此IMI+細胞可間接反映PBSC骨髓多能干細胞無法檢測,而?！奘杉毎湫纬蓡挝幌翟煅杉毎只鴣硎窃煅婕毎?HPC)的一種基于骨髓和外周HPC表達同樣的CD34+因此可用流式分析HPC, 含CD34+細胞不是單一細胞而是包括原始到不成熟粒細胞的連續(xù)分布群。因此在血細胞分析儀上利用幼稚細胞的檢測可間接反映HPC,2.有核紅細胞的測定將

15、血液和測定有核紅細胞的試劑相混合，正常紅細胞中的血紅蛋白滲出，只剩下光學透明的細胞膜或碎片。有核紅細胞和白細胞被試劑中的聚次甲基染料快速滲入。但有核紅細胞的核很難和染料結(jié)合，因為它的核染色質(zhì)發(fā)生固縮，不易著色。著色后的細胞排成流式細胞，并被633nm的紅色激光束照射，測得細胞所產(chǎn)生的前向散射光強度和側(cè)熒光強度。二維散射圖的橫坐標表示側(cè)熒光強度、縱坐標表示前向散射光強度。,以前檢測有核紅細胞的分析系統(tǒng)中，用酸性低滲性鹽溶液作為溶血素，用

16、PI（propidium iodide）或EB溴化乙啶 （ethidium bromide）染有核紅細胞的核，，但是該方法不能從損傷（死亡）的淋巴細胞中區(qū)分有核紅細胞,3.網(wǎng)織紅細胞檢測(血細胞分析儀器)1.用新亞甲藍(A 液) 染紅細胞內(nèi)RNA;再用含透明劑的硫酸(B 液) 使紅細胞內(nèi)血紅蛋白溢出,成為影細胞,處理后的血液在儀器上應用VCS原理進行檢測(Coulter)2.將抗凝全血加入網(wǎng)織紅細胞試劑(氧氮雜芑750)中，孵育1

17、5~45 min上機測定，數(shù)據(jù)分析由儀器中網(wǎng)織紅細胞分析程序完成，無需人工干預。(Technicon H*3) 此兩種方法均為人工機外染色,3. Sysmex 早期采用堿性槐黃作染料,用于網(wǎng)織紅計數(shù)儀(R系列). 后采用激光流式原理和細胞核酸染色。除了進行自動的 RET 數(shù)目和百分比計數(shù)外，還可以通過核酸染色得到的熒光信號強度區(qū)分低、中、高熒光強度的網(wǎng)織紅（ LFR 、 MFR 、 HFR ）。由于幼稚的網(wǎng)織紅熒光信號較強， MFR

18、 和 HFR 之和即反映未成熟網(wǎng)織紅的一個有用參數(shù)RMI .(XE-2100 、 XT-2000i )。,4.運用免疫表型法配合VCS檢測技術分析CD4、CD8白細胞亞群先以抗CD4及CD8的抗體包被乳膠球標記CD4、CD8陽性細胞，被標記的細胞在激光散射的特性方面與其它細胞明顯不同，上機后可被儀器識別并計數(shù)?？稍?分鐘內(nèi)快速得到CD4、CD8細胞的絕對值、百分比、和CD4／CD8比值,5.網(wǎng)織血小板檢測 網(wǎng)織血小

19、板（Reticulated Platelets, RP）是從骨髓釋放入血的新生血小板，與成熟血小板相比 ，體積大，蛋白質(zhì)合成能力強，RNA含量多。1 網(wǎng)織血小板的得名:1969年國外學者應用新亞甲藍染料,對犬外周血進行染色，發(fā)現(xiàn)血小板內(nèi)有一種網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)物，故將這一部分血小板命名為網(wǎng)織血小板 2 網(wǎng)織血小板檢測方法 :熒光色素-噻唑橙（thiazole orange,TO）。奧黃O（Auramine O,AO）,四.保證計數(shù)精密

20、度\準確性的技術1容量限定:⑴稀釋液容量控制 ⑵浮球定量2控制細胞通過小孔時及計數(shù)準確性的技術 ⑴重疊校正 ⑵脈沖編輯 ⑶高精度體積分析 ⑷掃流技術 ⑸鞘流技術 ⑹浮動界

21、標技術 ⑺延時 計數(shù) ⑻電子擬合曲線,在目前國內(nèi)眾多的五分類血液分析儀當中，主要品牌有：光電、ABX、東亞，庫爾特、雅培、拜爾,COULTER MAXM五分類血細分析儀集庫爾特原理及VCS技術于一身，提供完整的白細胞五項分類和全血細胞計數(shù) 運用流體動力（鞘流）令細胞成單一排列，逐個通過檢測位置，每個細胞同時接受VCS三項技術的測量，VCS測量技術包括細胞

22、體積(V),細胞傳導性 (C)及細胞激光散射性（S）。以活性染料新亞甲藍（NMB）對網(wǎng)織紅細胞進行染色，漂清本底后，運用激光散射技術從成熟的紅、白細胞和血小板中辨別出網(wǎng)織紅細胞并計數(shù)。,XE-2100   XE-2100采用了先進的半導體流式細胞分析系統(tǒng)結(jié)合核酸熒光染色技術，是目前世界上速度最快的血液分析儀器（150個標本/小時）；同時還可以為臨床提供更多的定量的檢測參數(shù)，包括有核紅細胞（NRBC）、造血祖細胞（HPC）、未