分子診斷學緒論感染性疾病的分子診斷教育

1、,,整體水平,細胞水平,分子水平,Chapter 6 核酸的分離與純化Chapter 7 重組DNA技術Chapter 8 臨床基因擴增檢驗技術Chapter 9 核酸分子雜交技術,Chapter 10 核酸測序技術Chapter 11 生物芯片技術Chapter 12 基因變異檢測技術、脈沖電場凝膠電泳、分子影像Chapter 13 生物信息學在分子診斷中的應用,Section 1 分子診斷學的性質、任務和特點,分子診斷學

2、(molecular diagnostics)，利用分子生物學技術研究機體外源和內源性生物大分子和大分子體系的存在、結構或表達調控的改變，從而為疾病的防治提供分子水平信息。,分子診斷學的任務,闡明疾病發(fā)生、發(fā)展的分子機制；分子診斷指標；建立檢測方法,分子診斷學的特點,屬于病因學診斷，特異性高；對某些基因變異做出判斷；有更好的發(fā)展前景,Section 2 分子診斷學的歷史、現(xiàn)狀和未來,疾病基因突變譜，尤其是單核苷酸多態(tài)性(sing

3、le nucleotide polymorphism, SNP)圖譜的建立，為分子診斷提供了強有力的工具。,基礎篇內容,Chapter 1 基因組 GenomeChapter 2 原核生物基因組ProkaryoticChapter 3 真核生物基因組EukaryoticChapter 4 病毒基因組 VirusChapter 5 蛋白質組學 Proteomics,技術篇內容,,Chapter 14 感染性疾病的分子診斷,Key

4、PointsMolecular diagnosis of infection disease means to estimate a disease through detecting the existence of gene of pathogenies directly, which is a relatively simple, rapid, specific and sensitive strategy of diagnos

5、is. pathogeny：病原，發(fā)病機理,There are two main kinds of molecular techniques which are used to molecular diagnosis of infection disease, amplifying DNA probe signals and amplifying target DNA fragment. amplify：放大；pro

6、be：探針,3. Associated with conventional diagnosis methods, molecular diagnosis can be used to diagnose infection disease induced by virus, bacteria, leptospira螺旋體, chlamydia衣原體, mycoplasma支原體 and rickettsia立克次體, etc.,4.

7、Compared with other conventional diagnosis methods, molecular diagnosis has many advantages in early diagnosing infection disease, identifying the genotype of pathogenies, detecting drug resistance gene, epidemiologic in

8、vestigating and supplying reliable evidence for clinical diagnosis and treatment.,感染性疾病的分子診斷主要是針對侵入人體內的病原體基因進行檢測。不同的病原體有各自的種屬特異的基因。前人鋪路，后人受益,Section 1 總論一、感染性疾病分子診斷的策略,一般性檢出策略：只需要提供是否有某種病原體的感染通過探針或擴增技術直接檢出病原微生物的DNA/R

9、NA，判斷有無感染或何種感染,2. 完整檢出策略：不僅對病原體做出判斷，還要進行分型（包括亞型）和耐藥性方面的檢測。 思路：診斷—分型—亞型—耐藥性檢測,二、感染性疾病分子診斷的常用方法,信號放大檢測技術方法 不涉及靶分子擴增，采用多酶、多探針或二者結合等方式增加探針標記物的濃度從而使信號得到放大，提高檢測的靈敏度。如：液相雜交、雜交捕獲及支鏈DNA（bDNA）等特點 美國FDA批準的商業(yè)試劑盒

10、 感染因素少，無擴增所產生的污染 穩(wěn)定性、重復性和特異性都較高，結果準確 放大倍數(shù)少，靈敏度較低,2. 靶分子擴增技術檢測方法 即方法中包含靶分子（DNA、RNA或探針）的擴增過程的技術。如PCR及衍生的擴增技術、連接酶鏈反應（LCR）、替代的擴增方法（TAS/SDA/NASBA等）特點 我國所售的商業(yè)試劑盒 簡便、快速、靈敏度高 存在擴增所帶來的

11、污染問題,三、感染性疾病分子診斷的標本處理,標本的選擇標本量及抗凝劑標本的傳送、保存標本的預處理,標本的選擇與傳統(tǒng)一樣，標本的選擇要符合疾病的發(fā)病機制，能反映病程的狀態(tài)。由于檢測方法的高靈敏性，可適當考慮標本采集的便利性和通用性。由于核酸樣本的穩(wěn)定性，可選用福爾馬林及石蠟包埋固定的組織標本。核酸的選擇對疾病的判斷也很重要。什么時候用DNA？什么時候用mRNA?,標本量及抗凝劑少量標本：100ul-500ul不等

12、，至多1ml。不同的檢測方法，所需的標本量不一樣?？鼓齽篍DTA、檸檬酸、草酸鹽、肝素。肝素對轉錄酶和聚合酶有抑制作用，因此，基于PCR的檢測方法一般不用肝素抗凝。,標本的傳送、保存根據(jù)標本的種類和檢測目的，建立合理的運送體系。保證核酸完整性，防止標本相互間的交叉污染。,標本的預處理核酸的提取(DNA提取、 RNA提取)擴增抑制物的去除危險病原體的滅活,四、感染性疾病分子診斷的結果解釋,解釋應包括病原體的生物學

13、、病理學特征、實驗技術的優(yōu)點及局限性。陰性結果陽性結果定性檢測結果疾病狀況的判斷,陰性結果解釋檢查質控是否正常。檢查檢測靈敏度、核酸提取量及擴增效率是否正常。引起假陰性的因素：樣品量不足、標本類型不恰當、收集時間不符合要求、運輸過程中樣本降解。,陽性結果解釋檢測質控是否正常。注意檢測的特異性和可能受到的污染等情況。產生假陽性的因素：引物探針的特異性、樣本在采集、運送和處理等不同環(huán)節(jié)中的交叉污染問題。,定性檢測結果

14、解釋考慮定性檢測的局限性考慮特定情況下，核酸樣本的穩(wěn)定性和不易降解性。,疾病狀況的判斷病原體存在與患病之間的相關關系為正確判斷疾病應：選擇具有代表性的標本，采用具有說服力的檢測方法，建立適量的臨界值。,五、感染性疾病分子診斷的臨床應用及評價,彌補血清學檢測技術的缺陷檢測不能培養(yǎng)或生長緩慢的病原微生物通過病原體的定量檢測監(jiān)測疾病微生物耐藥性的檢測細菌分型及流行病學的調查,Section 2 病毒的基因檢測,SARS相

15、關冠狀病毒的分子診斷,2003年4月，香港研究者Peiris等報告了50 例SARS病人的臨床表現(xiàn)和病毒學研究結果。一種新的冠狀病毒 (Coronavirus) 是SARS 的致病原因。 (Lancet, 2003, 361: 9365),2003年4月，德國漢堡Bernhard-Nocht熱帶醫(yī)學研究所學者Drosten等用隨機擴增技術，獲得一段長度為300bp的核苷酸序列。根據(jù)這段序列，建立了檢測新冠狀病毒的常規(guī)和實時定量P

16、CR技術。 (nejm.org on April 10, 2003）,檢測標本 痰液、咽拭子、鼻拭子、支氣管肺泡灌洗液 、血漿、糞便。檢測方法 1. 逆轉錄-巢式PCR (Reverse-Nested PCR) 2. 逆轉錄-實時PCR (Reverse-Real time PCR),有報道顯示，在可能SARS病人中病毒的檢出率為100%。在疑似SARS病人中的檢出率為23%。所有健康接觸者中未檢

17、測到病毒。,另一項研究顯示 檢測病毒的3種方法（血清學檢測、病毒分離、PCR技術）中，PCR技術的檢出率最高。,討論,疾病的早期即可獲得陽性結果(早于血清轉換期）。SARS患者中的陽性率約為80%，對照中的陰性率約為98%～100%。現(xiàn)有的PCR方法有較高的特異性但靈敏度較差，陰性結果不能排除病毒感染。,痰液中病毒RNA濃度極高，說明病毒從呼吸道排放是主要傳播途徑。血清中檢測到極低濃度的病毒RNA，提示病毒復制不僅發(fā)生于

18、呼吸道。病人恢復晚期的糞便中存在病毒RNA，說明糞便可能也是一種傳播途徑。鼻、咽子中含有的病毒RNA顯著少于痰液，提示不適合作為標本（有可能漏檢）。,SARS相關冠狀病毒基因檢測必須注意的問題,必須在規(guī)范的基因擴增實驗室中進行。應采取必要的質控規(guī)程，包括陽性對照和陰性對照。陽性結果時必須對原始樣本重復檢驗： 或者擴增另一個基因片段 或在另一個實驗室對同一樣本進行檢測。,肝炎病毒基因的檢測(hepatit

19、is B virus, HBV),乙肝病毒基因組中有4個ORF，分別稱為S、C、P和X。S區(qū)編碼HBV的包膜蛋白，C區(qū)編碼含HBeAg和HBcAg的多肽，P區(qū)編碼依賴RNA的DNA聚合酶。必須經(jīng)過逆轉錄復制過程，該病毒編碼的RNA-DNA polymerase缺乏校正功能導致變異率較高,臨床價值主要體現(xiàn)在：病情評估 血清中病毒含量的多少與肝臟病理損害程度相關，病毒載量越高，肝組織炎癥反應程度越重。療效預測 治療前病毒核酸載

20、量越高，療效越差；載量越低，機體清除病毒的可能性越大。,預后判斷病毒核酸載量持續(xù)處于高濃度者預后不良。垂直傳播途徑感染者，預后較差。反映肝細胞損害的其它指標正常，但病毒核酸水平經(jīng)常波動者更易發(fā)展為肝硬化。,病毒分型和耐藥檢測各個編碼區(qū)段存在著大量有意義的自然變異或藥物誘導的變異，并由此產生不同的變異株，從而導致HBV感染的不同血清學和臨床表現(xiàn)。檢測HBV的變異株對了解疾病機制、藥物耐受和指導用藥有一定的價值。參考ATCC

21、HepG2 Cell Culture,HPV基因的檢測在預防宮頸癌中的作用人乳頭瘤病毒(human papillomavirus, HPV),宮頸癌是常見的婦科惡性腫瘤之一，發(fā)病率在女性惡性腫瘤中居第二位，每年約有50萬左右新發(fā)病例。我國每年有新發(fā)病例約13.15萬，占世界宮頸癌新發(fā)病例總數(shù)的26%。,持續(xù)的人乳頭瘤病毒(human papillomavirus, HPV) 感染是引起宮頸癌和癌前病變的必要因素，93.0%-99.7

22、%的宮頸癌組織中均可檢測到HPV DNA。高危型HPV-16和HPV-18分別占宮頸癌的50%和14%。高危型HPV的持續(xù)感染可使患宮頸癌的風險增加250倍。,HPV DNA的檢測方法實時定量PCR (Real time PCR)核酸雜交捕獲（Hybrid CaptureII，HCII）,細胞學檢查結果為意義不明確的非典型細胞時，HPV基因的檢測能預測受檢者患宮頸癌的風險。細胞學檢查+HPV基因的檢測是宮頸癌前病變和宮頸癌篩查的

23、最佳方法，成為預防宮頸癌的關鍵,HIV基因的檢測人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV),參考NSFC申請材料,單純皰疹病毒(herpes simplex virus,HSV),巨細胞病毒(cytomegalovirus virus, CMV),Section 3 病原菌的基因檢測,結合分歧桿菌的基因檢測,結核分歧桿菌MTb，俗稱結核桿菌TB，是結核病的致病菌。帶病菌的痰液是TB主要的傳染

24、源。MTbH37Rv基因組結構：環(huán)狀雙鏈DNA，共4 411 529kb，富含重復序列尤其是插入序列、多基因的家族序列及重復的管家基因序列。,TB分子診斷方法1,臨床標本處理：標本：痰、胸腹腔積液、血清、尿液、腦脊液處理：液化劑去除粘蛋白，若帶血則用紅細胞裂解液去除血紅蛋白，提取DNA,TB分子診斷方法2,常用的是靶分子擴增方法：直接PCR法、SDA法、LCR法擴增片段：抗原蛋白編碼基因-165bp、MBP64-240bp、