生化藥物與基因工程藥物分析

1、第一節(jié) 概 述,,第一節(jié) 概 述,第一代生物藥物：生物體某些天然活性物質加工制成，例如胎盤制劑第二代：利用生化技術從生物材料中分離、純化獲得的，例如純化胰島素第三代：利用生物技術生產(chǎn)的天然生化物質及經(jīng)過生物工程手段改造的新物質,一、生物藥物的概念,利用生物體、生物組織或器官等成分，綜合應用生物學、生物化學、微生物學、免疫學、物理化學和藥學的原理與方法制的的一類藥物廣義：從動物、植物、微生物等生物體中制取的各種天然生物活性物

2、質以及人工合成或半合成的天然物質類似物,（一）生化藥物：,利用生物化學的理論、方法和技術，從動物、植物以及微生物等生物體中提取分離的天然活性物質，以及這些物質及其衍生物的化學合成、半合成和現(xiàn)代生物技術制的的產(chǎn)品。,例：氨基酸、多肽、蛋白質、酶等。,（二）生物技術藥物,生物技術：利用生物體或其組成部分發(fā)展產(chǎn)品的技術體系，生物技術作為一種手段可用以研究和開發(fā)新藥。生物技術藥物（生物工程藥物）：用生物技術研制的藥物,（三）基因工程藥物,先確

3、定對某種疾病具有預防和治療作用的蛋白質，然后將控制蛋白質合成過程的基因分離、純化或進行人工合成，利用重組DNA技術加以改造，最后將該基因放入可以大量生產(chǎn)的受體細胞中不斷繁殖或表達，并能進行大規(guī)模生產(chǎn)具有預防和治療這種疾病的蛋白質,（四）生物制品,應用普通的或以基因工程、細胞工程、蛋白質工程、發(fā)酵工程等生物技術獲得的微生物、細胞及各種動物或人源組織和體液等生物材料制備，用于人類疾病的預防、治療和診斷的藥品。,生物制品的分類,預防：菌苗（卡

4、介苗）、疫苗（乙肝疫苗）、類毒素（破傷風類毒素）治療：特異性治療用品（狂犬病免疫球蛋白）、非特異性治療用品（白蛋白）診斷：免疫診斷用品（結核菌素）,1. 生物體的基本生化成分 來自生物體，參與、調控和影響人體代謝和生理功能，在某些疾病治療時具有針對性強、毒副作用小的特點。部分蛋白質藥物，極微量就可產(chǎn)生顯著效果。 2. 分子量大: 分子量一般為幾千至幾十萬，結構復雜，甚至不確定，分析和檢驗困難，常需純度分析和分子量測

5、定。,二、藥物治療控制的特點,3. 結構難確證：各種技術 4. 全過程的質量控制： 對酸、堿、熱、pH等敏感，嚴格控制實驗條件和鑒定質量?；蚬こ趟幬锉葌鹘y(tǒng)工藝生產(chǎn)的藥物要求更高。 5. 生物活性檢查多肽、蛋白質類藥物，除采用理化檢驗外，還需采用生物鑒定法證實其生物活性。,二、藥物治療控制的特點,6. 安全性檢查 熱源檢查、過敏實驗、致突變實驗 7. 效價

6、（含量）測定： 理化法：生物藥物和基因工程藥物 效價測定和活性測定：酶類藥物,二、藥物治療控制的特點,第二節(jié) 質量控制的項目和方法,來源和種類性狀鑒別檢查含量測定,,一、鑒別試驗 理化鑒別法：化學鑒別法 紫外分光光度法 HPLC法生化鑒別法：酶法 電泳法 樣品脫鹽后等電點聚焦法測定生物鑒別

7、法：血清學法 生物學法,,（一）理化鑒別法 1.化學鑒別法： 例：溶菌酶 +Cu2+ 絡合顯色,,2.紫外分光光度法 最大吸收波長固定不變，紫外光譜圖一致 溶劑：0.01mol/L鹽酸例：三磷酸腺苷二鈉 濃度：20μg/ml 判斷： λmax：257±1nm

8、 3. HPLC法： 利用對照品溶液和供試品溶液色譜圖的保留時間和肽圖譜的一致性進行鑒別。,,（二）生化鑒別法1.酶法： 例：尿激酶的鑒別---氣泡上升法 原理：,方法： 取小試管，加入尿激酶巴比妥溶液、牛纖維蛋白原溶液，再依次加入牛纖維蛋白溶酶原溶液、牛凝血酶溶液，迅速搖勻，立即置37℃±0.5℃恒溫水浴保溫，記時。反應系統(tǒng)在30～40秒內凝結，凝

9、結塊內有氣泡生成，15分鐘內凝結塊溶解，當凝結塊溶解時，氣泡逐漸上升。以0.9%氯化鈉作空白，同法 操作，凝結塊在2小時內不溶。,2. 電泳法：,帶電荷的供試品在惰性支持介質中，與電場的作用下，按各自的速度向其對應的電極方向泳動，使組分分離成狹窄的區(qū)帶。,2. 電泳法：以肝素鑒別為例。,,,,,與國家肝素標準品對照，其移動位置相應。,3. 樣品脫鹽后等電點聚焦法測定,基因工程藥物等電點不一致同一產(chǎn)品，不管有幾個等電點，批與批之間必

10、須一致,（三）生物鑒別法,1.血清學法體外的抗原抗體試驗。經(jīng)典血清學反應：凝集反應、沉淀反應、中和反應和補給結合反應免疫擴散、免疫電泳以及熒光標記、酶標記等高敏感的檢測技術,2. 生物法： 利用生物體進行試驗來鑒別藥物。 例：家兔驚厥試驗鑒別胰島素。 利用胰島素的降糖作用。給家兔大劑量注射胰島素，家兔驚厥，迅速靜注50%GS，驚厥停止。,一般雜質檢查：氯化物、硫酸鹽、銨鹽、鐵鹽、重金屬、酸度等特殊雜質檢查

11、：原料藥純度分析和生產(chǎn)過程中雜質的檢查,二 雜質檢查,（二）特殊雜質檢查,1.原料藥的純度分析多糖類純度分析：低聚糖及可能混入的核酸、蛋白質2.生成過程中雜質的檢查有傳統(tǒng)生產(chǎn)方法不可能存在的有害雜質，如內毒素、致敏原,生化藥物和基因藥物的含量表示方法：百分含量：適用于結構明確的小分子藥 物或經(jīng)水解后變成小分子的 藥物。生物效價或酶活力單位：適用于酶類、

12、 蛋白質類藥物。,三、含量（效價）測定,第三節(jié) 定量分析方法,理化分析法生化測定法生物檢定法,一、理化分析法,（一）化學分析法重量法：根據(jù)樣品中分離出的單質或化合物的重量測定所含成分的含量。滴定分析法：根據(jù)生物制品中某些成分能與標準溶液定量的發(fā)生酸堿中和反應、氧化還原反應等特性，通過滴定過程而進行生物制品的含量測定的方法,（二）電化學分析法,電化學分析法：建立在物質在溶液中的電化學性質基礎上的一類儀器分析方法，通常將

13、試液作為化學電池的一個組成部分，根據(jù)該電池的某種電參數(shù)（如電阻、電導、電位、電流、電量或電流-電壓曲線等）與被測物質的濃度之間存在一定的關系而進行測定的方法。,（三）光譜法,1.比色法供試品中某些成分可與顯色劑發(fā)生顏色反應，根據(jù)顏色的深淺，與標準液進行同法處理后比較，即可測定含量。例：蛋白質與雙縮脲試劑發(fā)生顏色反應,（三）光譜法,2.紫外分光光度法：生物制品或相關的反應產(chǎn)物的紫外光譜在某一特征波長處有最大吸收，且一定的濃度范圍內與相

14、應的吸光度成正比，則可用于生物制品的含量測定,（三）光譜法,3.熒光分光光度法：利用物質吸收較短波長的光能后發(fā)射較長波長特征光譜的性質，對物質定性或定量分析的方法。可以從發(fā)射光譜或激發(fā)光譜進行分析。該法靈敏度高(通常比紫外分光光度法高2～3個數(shù)量級)，選擇性好。,（四）高效液相色譜法,具有高效分析、靈敏檢測、操作簡便的優(yōu)點分離過程中不破壞分離樣品的特點適合于對高沸點、大分子、強極性和熱穩(wěn)定性差的生物制品的定量分析,二、生化分析法

15、（一）酶法,以酶為分析對象的分析：酶活力測定法目的是測酶的活性或活力以酶為分析工具或分析試劑的分析方法：酶分析法主要測定樣品中酶以外其他物質的含量,1）基本概念： 酶活力是指酶催化一定化學反應的能力。酶活力測定實質上是測定一個被酶所催化的化學反應速度。酶反應速度越快所表示的酶活力越高。 酶反應速度可以用單位時間反應底物的減少或產(chǎn)物的增加來表示。,1.酶活力測定法,1）基本概念：酶單位：任何一種酶，在25℃以最適當?shù)牡孜?/p>

16、濃度、最適當?shù)木彌_液離子強度以及最適當?shù)膒H等條件下，每分鐘能轉化一個微摩爾底物的酶量定為一個活性單位（國際單位，IU）,1.酶活力測定法,1）基本概念：酶的比活性：為每毫克蛋白質所具有的酶單位數(shù)，一般用酶活力單位/mg蛋白質表示。,1.酶活力測定法,酶反應進程曲線 縱坐標為底物或產(chǎn)物的變化量，橫坐標為反應時間，曲線斜率表示反應速度。從酶反應進程曲線求得反應的初速度。酶濃度曲線 縱坐標為反應速度，橫坐標為酶量。通過酶濃度曲線檢驗反應

17、測定系統(tǒng)是否適宜。,,,2）酶促反應的條件及影響因素 底物的濃度：一般選用底物的濃度[S]=100Km。 pH：選用一個適宜的緩沖離子和離子強度、 適宜的pH值的緩沖系統(tǒng)來控制pH。 溫度：酶反應的溫度通常選用25℃、30℃或 37℃，實驗中溫度變動應控制在±0.1℃以內。 輔助因子：有些酶需要金屬離子，有些需要 相應的輔酶。,3）測定方法：取樣測定法、連續(xù)

18、測定法取樣測定法：在酶反應開始后不同的時間，從反應系統(tǒng)中取出一定量的反應液，并用適當?shù)姆椒ㄍＶ蛊浞磻?，再根?jù)底物和產(chǎn)物在化學性質上的差異，用適當?shù)臋z測方法進行定量分析，求得單位時間內酶促反應變化量的方法。連續(xù)測定法：在反應過程中對反應系統(tǒng)進行直接連續(xù)監(jiān)測的方法。,4）酶活力測定的方法檢測方法：紫外-可見分光光度法 旋光法熒光分光光度法 電化學測定法 酶偶聯(lián)測定法 離子選擇性電極測定法等。,2.酶分

19、析法 分析對象是酶的底物、輔酶活化劑、酶的抑制劑。 1.動力學分析法 2.總變量分析法本法又稱為平衡法或終點法。 僅適用于底物的測定。,（二）電泳法 電泳法可分為三大類：自由界面電泳、區(qū)帶電泳、高效毛細管電泳（HPCE)。根據(jù)所用支持物的不同分為：紙電泳法、醋酸纖維素薄膜電泳法、PAGE法、SDS-PAGE法、瓊脂糖凝膠電泳法,1、自由界面電泳：在一根U形管里的溶液中，同種分子的構型及荷電情況基本一致，在電

20、場影響下，它們逐漸密集而與其他電泳遷移率不同的物質之間形成明顯的界面。,2、區(qū)帶電泳：在電泳過程中，應用各種不同的惰性支持介質，在電場作用下，使具有不同泳動速度的組分形成各自區(qū)帶的電泳。常用的支持物有：濾紙、醋酸纖維素薄膜、聚丙烯酰胺凝膠（PAGE）、十二烷基硫酸納-聚丙烯酰胺凝膠（SDS - PAGE ）。,3、高效毛細管電泳法（HPCE）在一根內徑約50um的毛細管中，在高壓電場下進行樣品分離分析的一種新型電泳技術。,三、生物檢定