一種檢測遺傳毒性物質的熒光生物傳感器的構建.pdf

1、水環(huán)境中的有毒有害人工合成有機污染物主要來源于各種點源排放途徑匯集到水體。其中許多已經被證實即使在極其微量的情況下也會對機體產生諸如致突變、致癌、破壞生殖、干擾內分泌等危害。同時部分水中有機污染物具有高生物富集性與環(huán)境高滯留性,對人類健康產生嚴重的負面影響。由于水中有機污染物常以混合的方式聯(lián)合作用于人體,其遺傳毒性與致癌性之間存在一定的相關性,所以,常通過檢測水中混合有機物的遺傳毒性來評價其對人體健康的影響。
　　 檢測水體遺傳

2、毒性的方法很多,但是真正通過驗證的方法很少,不超過10種,特別是快速的成熟、可靠檢測方法更少。為了高效、快速檢測水中遺傳毒性,本研究通過基因工程的手段,構建了一種靈敏度高的檢測遺傳毒性物質的微生物發(fā)光傳感器,并優(yōu)化了其檢測性能。
　　 用PCR的方法分別擴增出強啟動子Pcda和編碼綠色熒光蛋白EGFP的基因,用PCR方法把兩者連接起來,與載體P-20連接構建成重組質粒PSK-EGFP,經測序比對后,轉化到鼠傷寒沙門氏菌TA153

3、5得到重組工程菌株。采用紫外光激發(fā)和熒光顯微鏡觀察,菌體發(fā)出綠色熒光,表明重組發(fā)光工程菌構建成功。分別對培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間、pH和不同細胞密度等影響反應條件進行優(yōu)化。先測定了12h的生長曲線,重組發(fā)光細菌在2-8 h為對數生長期,為實驗反應最佳時間。對不同培養(yǎng)溫度比較,發(fā)現(xiàn)30℃培養(yǎng)的相對37℃熒光強度更高,響應關系較好。不同初始pH值反應條件優(yōu)化,發(fā)現(xiàn)以純凈水作為培養(yǎng)條件的熒光強度pH6.5比pH7.0高,響應關系較好。對不同初始OD

4、值培養(yǎng)條件進行對比,當OD600為0.8左右時,響應關系為最好。
　　 利用不同陽性物質對重組發(fā)光細菌進行了敏感度的測試。用絲裂霉素C(MMC)進行濃度梯度測試,發(fā)現(xiàn)重組發(fā)光細菌對MMC的響應最好,在10-1-10-6由μg/ml濃度范圍內,其熒光強度隨著濃度的增加而增加。當濃度低至10-6μg/ml范圍,其相對熒光強度2左右,達到統(tǒng)計學顯著差異水平,表明重組發(fā)光細菌TA1535的對MMC的最低檢測濃度為10-6μg/ml。對4

5、-NQO的濃度梯度測試,發(fā)現(xiàn)在濃度10-1.-10-4μg/ml濃度范圍內,其熒光強度隨著濃度的增加而增強。當濃度為0.1μg/ml時,響應最好。當濃度為10-4μg/ml,熒光強度和1μg/ml基本一致,其相對熒光強度低于1.5,其響應較差。我們得出4-NQO濃度10-4μg/ml重組發(fā)光細菌的檢測下限。敵克松的濃度梯度測試結果,發(fā)現(xiàn)重組發(fā)光細菌對敵克松響應較差,當濃度為3μg/ml時,敵克松誘導綠色熒光蛋白表達達到最大,其相對熒光強