gateway技術(shù)

1、Gateway技術(shù)提供以下可能：通過(guò)去除冗長(zhǎng)的亞克隆步驟節(jié)省您的時(shí)間同時(shí)將您的基因轉(zhuǎn)移到多個(gè)表達(dá)系統(tǒng)在任何您選擇的系統(tǒng)――體外，細(xì)菌，酵母，昆蟲(chóng)，或哺乳動(dòng)物――分析表達(dá)一、一種更好的克隆方法一、一種更好的克隆方法Gateway技術(shù)能夠克隆一個(gè)或多個(gè)基因進(jìn)入到任何蛋白表達(dá)系統(tǒng)（圖1）。這項(xiàng)強(qiáng)大的體外技術(shù)大大地簡(jiǎn)化了基因克隆和亞克隆的步驟，而同時(shí)典型的克隆效率高達(dá)95%或更高。當(dāng)基因在目的表達(dá)載體之間快速簡(jiǎn)便的穿梭時(shí)，還可以保證正確的方向和

2、閱讀框。Gateway也有助于進(jìn)行帶不同數(shù)目純化和檢測(cè)標(biāo)簽蛋白的表達(dá)。圖1Gateway技術(shù)的靈活性Gateway技術(shù)：克隆、表達(dá)新方法zhchyuan2008zhchyuan2008的博客目的基因克隆進(jìn)入門(mén)載體后，可以同時(shí)轉(zhuǎn)移目的基因到多個(gè)目的載體。Gateway利用了位點(diǎn)特異重組，所以在構(gòu)建入門(mén)載體后，不再需要使用限制性完成構(gòu)建Gateway表達(dá)克隆僅需兩步（圖2）：（1）創(chuàng)建入門(mén)克隆，通過(guò)PCR或傳統(tǒng)的克隆方法將目的基因克隆進(jìn)入門(mén)

3、載體。（2）混合包含目的基因的入門(mén)克隆和合適的目的載體以及GatewayLRClonase酶，構(gòu)建表達(dá)克隆。（表達(dá)克隆用來(lái)在合適的宿主中進(jìn)行蛋白的表達(dá)和分析。）有幾種方法可以構(gòu)建Gateway入門(mén)克隆。無(wú)論您選擇何種方法，創(chuàng)建的入門(mén)克隆都是準(zhǔn)備用來(lái)與各種目的載體進(jìn)行重組。（1）PCR克?。ǘㄏ騎OPO克隆至入門(mén)載體或與供載體BP重組）（2）限制性?xún)?nèi)切酶消化和連接進(jìn)入入門(mén)載體（3）使用pCMVSPT6或pEXPAD502構(gòu)建Gateway

4、兼容cDNA文庫(kù)（4）Gateway改造過(guò)的克隆資源這些克隆資源和cDNA文庫(kù)兩邊加有attB位點(diǎn)。這些克隆可以通過(guò)與供載體及BPGateway酶反應(yīng)轉(zhuǎn)換到入門(mén)載體。獲得已有克隆資源的更多信息。三、三、PCRPCR定向（定向（PCRDirectionalPCRDirectional）TOPOTOPO克隆克隆定向TOPO克隆使得克隆PCR產(chǎn)物和其它的DNA分子更加快速和有效。進(jìn)行5分鐘的簡(jiǎn)單連接，產(chǎn)生90%的重組子。您不僅會(huì)比用連接酶介導(dǎo)

5、的方法更快的獲得克隆，而且可以節(jié)省因第一次無(wú)結(jié)果而重復(fù)試驗(yàn)所額外浪費(fèi)的時(shí)間。定向TOPO克隆提供高效的一步法克隆策略，可以定向克隆平端PCR產(chǎn)物到入門(mén)載體。平端PCR產(chǎn)物定向克隆的效率90%，從而簡(jiǎn)化了篩選。同時(shí)不再需要連接酶、PCR后續(xù)步驟或者限制性?xún)?nèi)切酶。目前有兩種定向TOPO克隆載體。pENTRDTOPO和pENTRSDDTOPO（表2和圖3）有以下特點(diǎn)：位于PCR產(chǎn)物插入位點(diǎn)兩側(cè)的attL重組位點(diǎn)可以與Gateway目的載體進(jìn)行