流式細胞術樣品制備技術

1、流式細胞術樣品制備技術流式細胞術樣品制備技術流式細胞術對細胞的分析檢測必須基于單細胞的基礎上，這是流式細胞術的基本要求。因此就必須把實體組織制備成單細胞懸液。在應用FCM技術中，制備出合格的單分散細胞是流式細胞術樣本制備技術中重要的一環(huán)。它要求這種分散細胞方法既要使細胞成為單個細胞，又能保持細胞的固有生物化學成分及生物學特性。流式細胞術樣品制備大致可分為下面五個步驟：①取材：取手術或活檢組織必須具有代表性，如取手術腫瘤組織，必須取瘤細胞

2、生長旺盛部位；組織等標本必須在取材后保持樣本的新鮮；一般在室溫1個小時之內處理好樣本或及時用固定劑或低溫對組織進行保存；②對細胞的待測生物化學成分進行熒光染色；③按照廠家提供的軟件程序對樣本進行獲取、檢測和存儲；④再依照軟件提供的程序對檢測結果進行定量分析；⑤檢測分析結果在生物、醫(yī)學上的意義進行分析和評價。第1節(jié)樣本單細胞懸液的制備方法樣本單細胞懸液的制備方法一新鮮實體組織樣本的制備新鮮實體組織樣本的制備FCM對單細胞快速進行各種參數(shù)分

3、析必須基于單細胞基礎上，根據(jù)各種組織成分的特點，可選擇不同的分散細胞方法，以期達到單細胞產(chǎn)額高、損傷少的目的。盡管標本制備已形成了標準化的程序，但實際操作中總會出現(xiàn)這樣或那樣的問題。在實體組織分散為單個細胞過程中，解離的方法可能瞬間地或持久地影響細胞的性質、形態(tài)、結構、功能等。所以，在對各種不同組織進行分散選擇方法時，應盡量減少對細胞的這種影響。目前常用的分散組織細胞的方法有如下3種。（一）酶消化法酶消化法1作用原理：作用原理：對實體組

4、織分散的作用原理主要有3方面：①可以破壞組織間的膠原纖維、彈性纖維等；②可以水解組織間的粘多糖等物質；③可以水解組織細胞間的緊密聯(lián)結裝置的蛋白質物質。酶消化法是實體瘤、培養(yǎng)細胞分散為單細胞的主要方法之一。常用的酶類試劑有：蛋白酶類——胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、鏈酶蛋白酶和中性蛋白酶等，都能解離組織中的細胞。胰蛋白酶能水解脂鍵和肽鍵；膠原酶能降解幾種分子類型的膠原；溶菌酶能水解糖蛋白和肽的糖苷鍵；彈性蛋白酶能消化連接組織的糖蛋白和彈性蛋白的纖

5、維。不同酶對細胞內和細胞間不同組分有特異作用，可根據(jù)分散組織類型來確定使用的酶類。2注意事項：注意事項：①酶需要溶解于適當?shù)娜芤褐?，而這些溶液不致于造成酶效價降低；②要注意酶的使用濃度和消化時間；③要注意酶活性的PH值。如胃蛋白酶在堿性環(huán)境中失去活性，胰蛋白酶在中性溶劑中活性不佳等；④要隨時注意影響酶活性的其它因素，如酶的生產(chǎn)批號等。3方法學程序方法學程序（1）將適合于酶消化的組織置于離心管中；（2）將選好的酶溶液12ml加入盛有被消化

6、組織的試管中；（3）一般消化2030分鐘（恒溫37℃或室溫），消化期間要間斷振蕩或吹打；（4）終止消化，收集細胞懸液，以300目尼龍網(wǎng)過濾，除去細胞團塊，以低速成離心除①將組織切成薄片，置入試管中；②首先加入EDTA液5ml，室溫下0.5h，離心棄之；③再加入胰酶EDTA液5ml。在37℃恒溫水浴振蕩器內30min；④用300目尼龍網(wǎng)過濾，離心沉淀1000prm，5min。再以生理鹽水洗23次；⑤細胞固定或低溫保存?zhèn)溆?。以上幾種分散細胞

7、的方法都是目前對實體組織解聚的常用的方法。實驗證明，用化學試劑方法處理組織導致細胞成活率低，細胞產(chǎn)額低，細胞碎片和細胞聚集的量不穩(wěn)定；化學試劑可單獨使用，也可與其它方法結合使用；機械法常常造成嚴重的細胞損傷，單細胞產(chǎn)量低；酶學法、化學法對實體組織的分散解聚較理想，但對所測化學成分有不良影響。所以要根據(jù)實驗目的去選擇合適的單細胞懸液制備方法，才能獲得理想的樣本和更好的FCM檢測結果。（四）（四）注意事項注意事項①新鮮組織標本應及時進行處理

8、保存，以免組織在室溫下放置時間過長，產(chǎn)生中心組織壞死以及細胞自溶，影響FCM測定結果；②根據(jù)實驗目的選擇最隹的固定方法，以免由于固定劑的原因，造成FCM檢測結果的不穩(wěn)定；③酶學法要注意條件的選擇和影響因素，要注意酶的溶劑，消化時間、pH值、濃度等方面對酶消化法的影響。④需注意不同組織，選擇相應的方法；如富于細胞的組織——淋巴肉瘤、視神經(jīng)母細胞瘤、腦瘤、未分化瘤、髓樣癌以及一些軟組織肉瘤等，就不一定采用酶學法或化學法；往往用單純的機械法就

9、可以獲得大量高質量的單分散細胞；⑤在使用酶學方法時，要重視酶的選用，如含有大量結締組織的腫瘤——食管癌、乳腺癌、皮膚癌等，選用膠原酶較好，因為膠原酶具有在Ca、Mg存在或在血清狀態(tài)下不發(fā)生活性降低的特性。二組織活檢、內窺鏡取材標本單細胞懸殊液的制備組織活檢、內窺鏡取材標本單細胞懸殊液的制備正常組織、瘤組織和淋巴結等活檢組織以及內窺鏡（胃鏡、食管鏡等）取材標本，由于材料較少，制備起來比較麻煩。但其制備方法與實體組織基本相似。1取材后立即放

10、入盛少許PBS液青霉素小瓶中；2另取一只小燒杯，杯口用300目尼龍網(wǎng)蓋住并用線繩固定好，并用PBS液濕潤；取新鮮組織標本置尼龍網(wǎng)上；因標本量較少，尤其是內窺鏡取材只少要取3塊以上；3在操作前，先將剪刀用PBS液浸潤一下，然后開始剪碎組織；4先剪幾下，視基本無組織塊存在時，用原來裝標本的青霉素小瓶中的PBS液，沖洗細胞均漿并過濾于小燒杯中；如果這時仍有可見組織塊，再用剪刀剪碎，再加適量該PBS液沖洗，直至網(wǎng)上無組織塊為止。這樣可盡量多的收