dna損傷修復過程中h2ax磷酸化的調控及其意義

1、DNADNA損傷修復過程中損傷修復過程中H2AXH2AX磷酸化的調控及其意義磷酸化的調控及其意義陳麗萍朱小年(綜述)陳雯(審校)(中山大學公共衛(wèi)生學院預防醫(yī)學系廣東廣州510080)【摘要】組蛋白2A變異體(histonefamily2Avariant，H2AX)在DNA雙鏈斷裂(doublestrbreakDSB)損傷時可以發(fā)生不同的翻譯后修飾，包括磷酸化、乙?；?、甲基化和泛素化。通過這些修飾，H2AX標記損傷的DNA雙鏈，促進局部D

2、NA修復因子和染色體重塑因子的募集，維持基因組的穩(wěn)定性。這對于DSB的有效修復及細胞周期從周期檢查點的恢復都是十分必要的。另外，H2AX在DSB信號通路必不可少的作用及其在腫瘤發(fā)生早期被激活事件，使它成為腫瘤生物學研究中的熱點基因蛋白。本文中重點闡述近幾年H2AX在DSB損傷修復中的研究進展，同時提出將它作為一個表觀遺傳標記，在人類腫瘤的早期診斷和治療中的潛在應用價值?！娟P鍵詞】H2AX磷酸化DNA損傷反應單倍劑量不足中圖分類號：R73

3、0.231文獻標識碼：A文章編號：1004616X(2011)02014804doi:10.3969j.issn.1004616x.2011.02.016組蛋白2A變異體(histonefamily2Avariant，H2AX)是核心組蛋白H2A的一個亞型，最早于1980年由West和Bonner首先報道[1]。和其他H2A家族成員一樣，H2AX的殘基末端也能發(fā)生甲基化、乙?；土姿峄揎?。H2AX的獨特之處在于羥基末端由4個氨基酸SQ

4、(E、D)(I、L、F、Y)組成的高度保守序列，稱為SQE基序[2]。當細胞發(fā)生DNA損傷時，SQE迅速發(fā)生磷酸化，產生γH2AX。H2AX是最早被磷酸化的底物，在電離輻射1～2min可以出現(xiàn)，30min達到最高，是細胞中感應DNA損傷最敏感的分子。γH2AX焦點的數量和大小可以通過免疫熒光或細胞流式技術檢測得到，且數量和大小與一定范圍的損傷劑量相關。所以，越來越多的研究提出γH2AX是DNA損傷的一個很好的蛋白標記物[34]。γH2A

5、X不僅參與DNA雙鏈斷裂(doublestrbreakDSB)的識別和修復，還與P53相互作用，激活細胞周期檢查點，阻滯細胞周期，為DNA損傷修復贏得時間，保證遺傳信息的正確。所以γH2AX可作為基因組的“監(jiān)視器”，當修復不能完成時，阻滯細胞周期，誘導細胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)H2AX敲除的小鼠表現(xiàn)對電離輻射敏感性和腫瘤易感性增加[5]，可能是因為H2AX的缺失，不能有效修復DNA損傷，最終導致基因組不穩(wěn)定。這提示H2AX在維持基因組穩(wěn)定性過程

6、中起重要作用。本文將重點綜述H2AX在募集DSB修復因子、染色質重塑復合物和cohesin復合物到DNA損傷位點進行修復，及在哺乳動物中γH2AX移除機制的研究進展，并闡述H2AX作為一個表觀遺傳的生物標志物在人類腫瘤研究中的應用。1組蛋白H2AX調控DNA雙鏈斷裂的修復過程1.1組蛋白H2AX磷酸化外源因素如電離輻射、紫外線及化學物喜樹堿、博來霉素和羥基脲，內源性包括正常代謝產生的ROS、細胞的衰老和凋亡、DNA修復缺陷、V(D)J重

7、排和減數分裂都會引起DSB，伴隨H2AX的磷酸化和聚集。真核生物中，H2AX的磷酸化由PIKKs家族，包括ATM(ataxiatelangiectasiamutated)、ATR(ATMRad3relatedprotein)和DNAPKs(DNAdependentproteinkinase)介導[6]。ATM主要介導DSB形成時H2AX的磷酸化，ATR主要在單鏈損傷和復制損傷中起作用，DNAPKs則介導細胞凋亡過程中產生DNA碎片時的H

8、2AX磷酸化，而所有激酶都可能參與電離輻射引起的DNA損傷。γH2AX可通過Westernblotting檢測或應用免疫熒光技術，在熒光顯微鏡下可清楚觀察到以γH2AX焦點形成為特征的DNA雙鏈斷裂的區(qū)域，且1個γH2AX焦點對應1個DSB[7]。在哺乳動物細胞中，每產生1個DSB約有0.03％的H2AX磷酸化，相當于H2AX隨機分布于2Mb染色質區(qū)域，而免疫細胞化學分析表明這一區(qū)域比實際形成點的區(qū)域大10倍，說明并不是每一鄰近的H2A

9、X分子均會發(fā)生磷酸化[7]。4Pi顯微鏡觀察到H2AX并不是隨機分布的，而是成簇分布在基因組中[8]。那么，在沒有組蛋白H2AX分布的區(qū)域DNA損傷反應是如何發(fā)生的仍不清楚，且H2AX和某些損傷相關因子的分布不同，是否可以用來解釋一些區(qū)域對DNA損傷易感而一些區(qū)域耐受？這需要進一步的研究來回答。Siino等[15]觀察到帶GFP標簽的組蛋白在染色質中緩慢移動，但3～4h后，約50%帶標簽的組蛋白被交換[21]。最近的體外實驗也表明H2A

10、X與H2A的交換是由FACT——由Spt16和SSRP1組成的二聚體酶介導的，并通過H2AX的磷酸化和Spt16的ADP核糖化來調節(jié)[17]。這些都提供了γH2AX焦點通過組蛋白交換來移除的證據。②蛋白磷酸酶使γH2AX去磷酸化。在酵母中，γH2AX的同源物首先從染色體被移除，接著在組蛋白H2A磷酸酶復合物(HTPC)上去磷酸化，其中一個亞基是Pph3，與PP2A60%同源，且γH2AX從染色體釋放之后，去磷酸化立即被活化[22]。研究

11、發(fā)現(xiàn)PP2Cγ亞基也可能介導γH2AX的去磷酸化，并作為儲存H2AH2B或者是H2AXH2B二聚體的分子伴侶[23]。最近研究認為蛋白磷酸酶能靶向γH2AX，并使其去磷酸化[2425]。Chowdhury等[24]發(fā)現(xiàn)在人類細胞株的DSB修復中，PP2A參與移除γH2AX焦點。通過進一步的CoIP觀察到PP2Ac亞基直接與γH2AX結合。將C亞基干擾之后γH2AX焦點持續(xù)存在，導致修復無效或者修復不完全，對DNA損傷更加敏感。此外PP4

12、、PP6復合物也參與了DNA損傷時產生的γH2AX的去磷酸過程[2628]，并認為不同蛋白磷酸酶可能負責去磷酸化不同來源DNA損傷誘導的γH2AX。alpha4蛋白干擾后也會導致H2AX的持續(xù)磷酸化，使修復不能完成，細胞生長阻滯或死亡[29]。最新研究發(fā)現(xiàn)在電離輻射和紫外線作用下，野生型P53介導的磷酸酶1(WIP1)也可以使γH2AX去磷酸化[30]，WIP1的抑制損害DSB的修復。然而，去磷酸化是發(fā)生在核小體上還是從核小體移除之后尚

13、不清楚，也不清楚參與去磷酸化的PP2A全酶的具體組合。針對不同損傷，蛋白磷酸酶如何分工合作及其作用的模式，是將來研究的方向之一。2H2AX與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關系及其臨床應用2.1H2AX與腫瘤人類H2AX基因(H2AFX)位于11號染色體11q23，這個區(qū)域的普遍缺失或易位出現(xiàn)在很多人類腫瘤中，如血液性惡性疾病和實體腫瘤。目前已經報道了很多DDR(DNAdamageresponse)基因如ATM、MRE11A、CHEK1和H2AFX在人類

14、腫瘤中存在突變和缺失，通過單倍劑量不足(haploinsufficiency)導致腫瘤的發(fā)生[31]。Alt[32]報道了H2AX和ATM的雙敲除對于胚胎是致死性的，然而雙缺失的小鼠也表現(xiàn)出嚴重的生長遲緩和基因組不穩(wěn)定。這表明DDR基因的突變或者缺失共同作用促進腫瘤的進展。Bassing等[5]將小鼠的H2AX基因敲除后，小鼠表現(xiàn)出對射線敏感、生長遲緩、免疫缺陷和雄性不育，這可能與基因組不穩(wěn)定，修復缺陷和不能募集修復蛋白NBS1、53B

15、P1和BRCA1到IRIFs進行修復相關。H2AX基因缺失的細胞株對藥物的敏感性增加[33]，損害了基因組的完整性。當在胚鼠纖維細胞中重建H2AX等位基因可以逆轉基因不穩(wěn)定性和放射敏感性。這表明可以通過H2AX單倍劑量不足的機制來抑制腫瘤，它要求兩個等位基因的功能正常。在頭頸部腫瘤中，Parikh[31]發(fā)現(xiàn)H2AFX的11q23區(qū)域部分缺失，表明H2AFX與人類腫瘤有關。另外，一些遠離H2AFX基因的啟動子區(qū)域的SNPs與乳腺癌和白血

16、病的發(fā)病相關[3435]。研究還發(fā)現(xiàn)γH2AX出現(xiàn)在人類一些癌前病變的損傷中，伴隨其他DDR信號的激活包括CHK2磷酸化，P53的積累和53BP1焦點形成。這表明DSB檢查點是癌變的早期階段抗腫瘤的障礙。另外，在消化道腫瘤細胞株中，使用一種臨床藥物蛋白激酶抑制劑甲磺酸伊馬替尼處理，可以誘導細胞凋亡，其機制是H2AX的上調[36]。這些研究都提供了H2AFX抑制人類腫瘤作用的可靠證據[37]。2.2H2AX的臨床運用目前，H2AX磷酸化已

17、經應用到有效的放射和介入治療中[38]。由于γH2AX參與DNA損傷修復，因此可通過抑制H2AX的上游激酶阻止H2AX被磷酸化，或應用潛在的電離輻射增敏劑，使γH2AX持續(xù)存在，DNA損傷不能完全修復，促進放射抵抗腫瘤細胞對放射和化療的敏感性[39]，從而提高腫瘤放療的有效性。同時，γH2AX廣泛運用作為細胞放射敏感性的指標，我們可根據放療后γH2AX的數量對照射劑量進行調整，針對不同的患者給以個體化的照射劑量。通過對γH2AX表達的檢

18、測，可以給預后評估提供參考[40]。越來越多研究認為γH2AX水平的升高作為活化DDR是癌前病變、腫瘤組織和培養(yǎng)的腫瘤細胞的一個共同特征[3435]。已經證實了一些致癌基因的活化是由一些內源或者環(huán)境致突變劑導致的復制壓力和DNA損傷，激活DDR的級聯(lián)反應[41]。所以，組織中的γH2AX水平可以反映出機體的基因組穩(wěn)定性，因此可以監(jiān)測癌前病變，以進行早期治療，且通過γH2AX水平檢測還可以進行腫瘤分期，預后評估監(jiān)測腫瘤療效及尋找新的抗腫瘤