醋酸纖維素薄膜電泳法分離血清蛋白質

1、生物化學實驗醋酸纖維素薄膜電泳法分離血清蛋白質一、實驗目的掌握醋酸纖維薄膜電泳法分離蛋白質的原理和方法二、實驗原理蛋白質是兩性電解質。在pH值小于其等電點的溶液中，蛋白質為正離子，在電場中向陰極移動；在pH值大于其等電點的溶液中，蛋白質為負離子，在電場中向陽極移動。血清中含有數(shù)種蛋白質，它們所具有的可解離基團不同，在同一pH的溶液中，所帶凈電荷不同，故可利用電泳法將它們分離。血清中含有白蛋白、α球蛋白、β球蛋白、γ球蛋白等，各種蛋白質由

2、于氨基酸祖墳、立體構象、相對分子質量、等電點及形狀不同，在電場中遷移速度不同。由表可知，血清中5種蛋白質的等電點大部分低于pH值7.0，所以在pH8.6的緩沖液中，它們都電離成負離子，在電場中向陽極移動。蛋白質名稱等電點相對分子質量白蛋白4.8869000α1球蛋白5.06200000α2球蛋白5.06300000β球蛋白5.1290000~150000γ球蛋白6.85~7.50156000~300000在一定范圍內，蛋白質的含量與結合

3、的燃染料量成正比，故可將蛋白質區(qū)帶剪下，分別用0.4molLNaOH溶液浸洗下來，進行比色，測定其相對含量。也可以將染色后的薄膜直接用光密度計掃描，測定其相對含量。腎病、彌漫性肝損害、肝硬化、原發(fā)性肝癌、多發(fā)性骨髓瘤、慢性炎癥、妊娠等都可以使白蛋白下降。腎病時α1、α2、β球蛋白升高，γ球蛋白降低。肝硬化時α2、β球蛋白降低，而α1、γ球蛋白升高。三、實驗器材1、醋酸纖維薄膜（2cm8cm，厚度120μm）2、人血清；3、燒杯及培養(yǎng)皿數(shù)

4、只；4、點樣器；5、竹鑷子；6、玻璃棒；7、電吹風；8、試管六只；9、恒溫水浴鍋；10、電泳槽；11、直流穩(wěn)壓電泳儀；12、7220型分光光度計；13、剪刀四、實驗試劑α1球蛋白比率==0.0491?A總Aα2球蛋白比率==0.0672?A總Aβ球蛋白比率==0.125?A總Aγ球蛋白比率==0.108?A總A七、實驗討論與總結1、什么是血清將抽取的血液置入不加抗凝劑的試管中，使血凝固，析出的上清液就是血清。血清中所含的蛋白成分與血漿相

5、比，少了纖維蛋白原，而主要是白蛋白、球蛋白。2、由于蛋白的絕大部分均由肝臟合成，所以，各種蛋白質的質與量的變化，除與免疫性疾病等有關外，主要反映肝臟的生理、病理情況。3、醋酸纖維素薄膜醋酸纖維素（二乙酸纖維素）薄膜具有勻一的泡沫狀結構，是由醋酸纖維素加工制成的。醋酸纖維素薄膜作為是電泳支持體有以下優(yōu)點：①電泳后區(qū)帶界限清晰；②通電時間較短（二十分鐘至一小時）；③它對各種蛋白質（包括血清白蛋白，溶菌酶及核糖核酸酶）都幾乎完全不吸附，因此無

6、拖尾現(xiàn)象；④對染料也沒有吸附，因此不結合的染料能完全洗掉，無樣品處幾乎完全無色。它的電滲作用雖高但很均一，不影響樣品的分離效果，由于醋酸纖維素薄膜吸水量較低，因此必需在密閉的容器中進行電泳，并使用較低有電流避免蒸發(fā)。醋酸纖維素薄膜經(jīng)14－二氧六環(huán)、透明液或液體石蠟處理即透明，因而可得背景為無色的電泳圖譜。4、血清提取蛋白從血清中提取的蛋白質，適用于食品工業(yè)的食品添加劑和醫(yī)藥制劑。通常提取蛋白質的方法是離心分離，除去血漿，使二價鐵血紅素酸

7、化，并將其排除。制作方法：取經(jīng)過穩(wěn)定的血液，作離心分離15～30分鐘，每分鐘轉速為2500～3000轉。從而取得固形物，去除血漿，用水使固形物沉渣溶解。置血紅素于培養(yǎng)基中。為了使培養(yǎng)基酸化而使血紅素分子中的二價鐵血紅素和血球蛋白的結合體分離預先制備好醋酸和氯化鈉的混合物并將它加熱到90～110℃。混合時將固形物的溶血產(chǎn)物緩慢地添加到加熱的混合物中。重新把溫度逐漸地升高到沸點，煮沸5～15分鐘，以便使結合體完全分離，接著將混合物逐步冷卻到

8、室溫。為了使二價鐵血紅素溶解并消除，在混合物中按溶物產(chǎn)物比值2∶1～5∶1添加乙醚。這時提取出來的蛋白質呈白棉絮狀。將溶液過濾，再用乙醚清洗。100毫升血中提取的蛋白質產(chǎn)品相當于14.4克。應用這種方法，每100毫升的血液可提高蛋白質得率45%。5、實驗總結本次實驗結果中，γ球蛋白測得的含量偏低，原因可能是在裁剪電泳條帶的時候遺漏了一條薄膜沒有剪下浸洗，分析即γ球蛋白；另外實驗室溫度比較低，電泳距離太短不利于觀察分析，應增大電壓增長電泳