20102617王淼姜黃素磷脂復(fù)合物的制備、藥效學(xué)評(píng)價(jià)及代謝動(dòng)力學(xué)研究

1、姜黃素磷脂復(fù)合物的制備、藥效評(píng)價(jià)及在大鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究,Kuntal Maiti， Kakali Mukherjee ， Arunava Gantait，Bishnu Pada Saha， Pulok K. MukherjeeJadavpur大學(xué) 天然產(chǎn)物化學(xué)學(xué)院制藥工程系 王淼 Shenyang Argiculture university （譯）,1前言2材料和方法3實(shí)驗(yàn)結(jié)果4討

2、論,Thank You！ December 22th 2010,1前言,1姜黃素簡(jiǎn)介2磷脂復(fù)合物的研究,,2材料和方法,2.1 材料 2.2 姜黃素磷脂復(fù)合物的制備 2.3 復(fù)合物中姜黃素含量測(cè)定 2.4 復(fù)合物的顯微特征 2.5 復(fù)合物的差示掃描熱特征 2.6 高效薄層色譜法研究 2.7 溶解性能研究

3、 2.8 抗氧化性活性測(cè)定 2.9 大鼠血清姜黃素含量的測(cè)定2.10 藥動(dòng)學(xué)參數(shù)研究2.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,,2.8 抗氧化性活性測(cè)定,2.8.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物2.8.2 劑量的確定2.8.3 酶活力的測(cè)定,,2.9 大鼠血清姜黃素含量的測(cè)定,2.9.1 血清中姜黃素提取和樣品的預(yù)處理2.9.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備2.9.3 有效提取含量的測(cè)定,,3實(shí)驗(yàn)結(jié)果,3.1 復(fù)合物中姜黃素含量3.2 復(fù)合物的顯微觀察結(jié)果3.3

4、差示掃描熱量吸收?qǐng)D譜3.4 高效薄層色譜的研究3.5 抗氧化酶的活性3.6 姜黃素在血清的濃度變化3.7 藥動(dòng)學(xué)參數(shù),,姜黃素（1,7-雙(4-羥基-3-甲氧基苯基)-1,6-庚二烯-3,5-二酮）著色劑和食品中的香料，具有抗氧化性、抗炎、抗癌、降低血液中膽固醇含量、抗感染、促進(jìn)傷口愈合、鎮(zhèn)靜、抗凝血、抗腫瘤以及保肝作用。姜黃素口服難吸收，在水中極難溶解，而且代謝途徑復(fù)雜多樣，因而也很難建立藥代動(dòng)力學(xué)模型。在嚙齒類(lèi)，姜黃素經(jīng)

5、過(guò)共價(jià)結(jié)合或還原等代謝，口服給藥的典型特征就是生物利用度極低。,,磷脂可以增強(qiáng)一些口服難吸收的藥物的療效。水飛薊賓就是其中一種口服生物利用度極低的藥物分子。水飛薊賓磷脂復(fù)合物，不僅增加了口服生物利用度，還提高了藥物療效。實(shí)驗(yàn)觀察到水飛薊賓磷脂復(fù)合物比單純水飛薊賓具有更好的護(hù)肝作用和抗氧化作用。槲皮素磷脂復(fù)合物對(duì)四氯化碳造成的大鼠肝臟急性損傷的治療效果優(yōu)于槲皮素。,,2.1材料,磷脂，氫化大豆磷脂酰膽堿（HSPC），購(gòu)買(mǎi)自德國(guó)路德維希港脂

6、質(zhì)化工廠；姜黃素購(gòu)買(mǎi)自美國(guó)Sigma Chemical；EDTA，丙二酰硫脲，三氯乙酸，羧甲基纖維素鈉，十二烷基硫酸鈉，正己烷和其他試劑購(gòu)買(mǎi)自印度Mumbai Loba Chemie；谷胱甘肽，谷胱甘肽還原酶，牛血清白蛋白，三羥基氨基甲烷緩沖液，四硝唑基藍(lán)，5,5'-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)，吩嗪N-甲硫酸鹽，正辛醇購(gòu)買(mǎi)自印度Mumbai SRL Chemicals 。,,2.2姜黃素磷脂復(fù)合物的制備,姜黃素和HSPC按摩爾比

7、為1：1稱(chēng)取，加到100毫升的圓底燒瓶中，加入20ml二氯甲烷，在不超過(guò)60℃的條件下攪拌2小時(shí)。將反應(yīng)后的溶液蒸干，加入10毫升正己烷繼續(xù)攪拌至姜黃素磷脂復(fù)合物析出，過(guò)濾，取沉淀減壓真空干燥，除去殘留的溶劑。反應(yīng)得到的姜黃素磷脂復(fù)合物（產(chǎn)率88%）放置于充氮?dú)獾淖厣恐?，室溫保存?,2.3復(fù)合物中姜黃素含量測(cè)定,姜黃素的含量測(cè)定選用Jayaprakasha等人研究的方法。稱(chēng)取約5毫克的磷脂復(fù)合物加入1毫升甲醇溶解，然后用甲醇定容至1

8、0毫升。測(cè)定的時(shí)每一次進(jìn)樣20微升，采用Waters-μ-Bondapack C18色譜柱（300mm×4.6mm），流動(dòng)相甲醇：2%醋酸：乙腈（V/V/V）為5：30：65 。洗脫液流速室溫控制在1.0毫升/分鐘，檢測(cè)波長(zhǎng)為425nm。,,2.4 復(fù)合物的顯微特征,采用Leica （ type DC 300F）顯微鏡 ，CH-9435 Heerbrugg 等來(lái)檢測(cè)復(fù)合物的顯微特征。復(fù)合物用蒸餾水分散后，取樣放在載玻片上，蓋上

9、蓋玻片進(jìn)行觀察。樣品的放大倍數(shù)為400倍。,,2.5 復(fù)合物的差示掃描熱特征,將樣品裝在密封的鋁制薄管中，在充滿(mǎn)氮?dú)獾姆磻?yīng)室內(nèi)，溫度從0℃以每分鐘10℃的速度上升至300℃。姜黃素、磷脂、姜黃素磷脂復(fù)合物以及姜黃素和磷脂的物理混合物的能量吸收跳躍以及差示掃描圖譜采用Mettler DSC 30S 系統(tǒng)進(jìn)行分析比較。,,2.6 高效薄層色譜法研究,姜黃素磷脂復(fù)合物和姜黃素均用甲醇制成溶液，然后將甲醇溶液點(diǎn)樣在預(yù)先鋪好硅膠60 F254 的

10、薄層色譜板上，展開(kāi)劑為二氯甲烷：甲醇（V/V）按照99：1的比例配制，薄層板在層析缸中的傾斜角度為70°。層析以后的薄層板采用 Camag TLC sacnner 3 進(jìn)行分析，并計(jì)算樣品的Rf值。,,2.7 溶解性能研究,為了測(cè)定室溫下姜黃素的溶解特性，分別去等量的姜黃素磷脂復(fù)合物和磷脂與姜黃素的物理混合物進(jìn)行試驗(yàn)，取樣品加入到5mL含水和正辛醇的溶液中?；旌弦后w振蕩24小時(shí)，然后5000轉(zhuǎn)每分鐘離心10分鐘。取上清液，過(guò)濾

11、，取續(xù)濾液1毫升用甲醇定容至10毫升，進(jìn)樣20微升，采用高效液相色譜法測(cè)定其含量，檢測(cè)波長(zhǎng)為425nm。,,2.8.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,雄性大白鼠（Wistar strain品系），體重180~200克。大白鼠7~8只一組，環(huán)境溫度20℃~25℃，相對(duì)濕度45%~55%，白晝各12小時(shí)。大白鼠自由采食和飲水。實(shí)驗(yàn)按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理規(guī)范（CPCSEA）的相關(guān)規(guī)定進(jìn)行。,,2.8.2 劑量的確定,大白鼠分成六組，每組六只。第一組每日灌服1%（v/v

12、）的吐溫20溶液，第二組只在第七天灌服單劑量的四氯化碳和橄欖油的混合物，三四組則每日用含吐溫20的姜黃素的混懸液處理，劑量分別為100和200mg/kg，五六組則每日用磷脂復(fù)合物處理，劑量分別為100和200mg/kg（按姜黃素計(jì)算），其余條件不變，正常飼養(yǎng)一周。第七天，所有對(duì)動(dòng)物都灌服單劑量的四氯化碳和橄欖油的混合物。,,2.8.3 酶活力的測(cè)定,所有動(dòng)物在第八天用乙醚麻醉后處死。動(dòng)物處死以后立即取出肝臟，攪碎，供生化測(cè)定用。肝臟用冰

13、塊預(yù)冷的生理鹽水沖洗，然后用pH7.4的Tris-HCl緩沖溶液制備勻漿。勻漿離心，取上清液，用之前報(bào)道的一些方法來(lái)測(cè)定谷胱甘肽還原酶，谷胱甘肽過(guò)氧化酶，谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶，谷胱甘肽還原酶類(lèi)，超氧化物岐化酶，過(guò)氧化氫酶等。硫代巴比妥酸的反應(yīng)活性測(cè)定采用Ohkawa等人研究的方法。蛋白質(zhì)含量測(cè)定用牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)。,,2.9.1 血清中姜黃素的提取和樣品的預(yù)處理,雄性白色Wistar品系大鼠，體重150~200克，分成兩組，每組六只。

14、其中一組灌服1.0g/kg體重的姜黃素，另一組灌服1.0g/kg體重的姜黃素磷脂復(fù)合物（以姜黃素計(jì)）。然后用乙醚麻醉大鼠，從頸靜脈每隔一定時(shí)間采取血樣。血樣在離心管中室溫放置1小時(shí)凝血，然后3000轉(zhuǎn)每分鐘離心10分鐘，分離得到血清，血清在-20℃保存?zhèn)溆谩?姜黃素的濃度采用高效液相色譜法測(cè)定。流動(dòng)相為甲醇2%乙酸：乙腈比列為5：30：65，流速控制1.0ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)425nm。取1mL血清，在其恢復(fù)至室溫前加入到

15、10毫升的容量瓶中，加入5毫升甲醇。水浴溫度75℃~80℃，強(qiáng)烈振搖溶液25~30min。然后取出溶液用甲醇定容至10毫升，轉(zhuǎn)移至15毫升離心管中，5000rpm，10min，分離的上清液。每次進(jìn)樣量為20微升。,,2.9.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備,取10mg姜黃素標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇溶解并定容至10毫升。取0.1毫升溶液，用甲醇稀釋為0.1ppm。,,2.9.3 有效提取含量的測(cè)定,大鼠血清中的姜黃素能夠通過(guò)提取分離完全，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)在0.05~2.0

16、ug/mL之間呈良好的線(xiàn)性關(guān)系（R值0.9925）。姜黃素的最低檢測(cè)限度為25ng/mL。通過(guò)加樣回收實(shí)驗(yàn)證實(shí)該方法的合理性。選擇濃度高中低三組，姜黃素的萃取效果和定量結(jié)果和以往的報(bào)道相符合。高中低三組姜黃素的回收率分別為83.25%，84.29%和82.70%。inter-days相對(duì)平均偏差分別為2.47%，3.24%和2.12%；intra-days 的RSD值分別為 3.56%，2.78%和3.48%。,,2.10 藥動(dòng)學(xué)參數(shù)研

17、究,姜黃素磷脂復(fù)合物的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)研究以姜黃素的藥動(dòng)學(xué)研究參照，用WINNONLIN-4.1對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。最大血清濃度和達(dá)到最大濃度所要的時(shí)間都可以從濃度-時(shí)間曲線(xiàn)上獲得。藥時(shí)曲線(xiàn)下面積(AUC0-tn and AUC0-tα)，清除半衰期(t1/2el)，消除速率常數(shù)(Kel)，清除率（Cl），表觀分布容積(Vd)等都可以測(cè)得。相對(duì)生物利用度(F)也可以通過(guò)下面的公式計(jì)算得到：,,2.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,數(shù)據(jù)均采用平均值±

18、標(biāo)準(zhǔn)誤差。以抗氧化活性為例，其數(shù)據(jù)的分析采用的是方差分析法和Dunnett’s test（丹內(nèi)特測(cè)驗(yàn)法）。而血清藥物濃度的研究采用的是Student’s “t” 檢驗(yàn)法。P值<0.05表示顯著差異。,,3.1 復(fù)合物中姜黃素含量,復(fù)合物中的姜黃素含量采用高效液相色譜法測(cè)定，結(jié)果為32.40%（w/w）。無(wú)論是水中還是正辛醇中，該復(fù)合物比姜黃素或者二者之間的物理混合物擁有更好的溶解性能。詳細(xì)數(shù)據(jù)如下表：,,3.2 復(fù)合物的顯微觀察結(jié)

19、果,,差示掃描熱量法是一種快速簡(jiǎn)便可行的檢測(cè)方法，尤其在檢測(cè)藥物與賦形劑的相互作用時(shí)可以提供大量信息。在DSC分析中，可以通過(guò)觀測(cè)吸熱峰的消失，出現(xiàn)新的吸熱峰，吸熱峰的形狀或峰高發(fā)生變化，峰值溫度、熔點(diǎn)、相關(guān)區(qū)域焓的變化都可以作為結(jié)果判定的依據(jù)。圖2中反映了各個(gè)組分的DSC熱解圖線(xiàn)。A為姜黃素，B為磷脂，C為姜黃素磷脂復(fù)合物，D為姜黃素和磷脂的物理混合物。,3.3 差示掃描熱量吸收?qǐng)D譜,,,3.4 高效薄層色譜的研究,,3.5 抗氧化酶

20、的活性,3.5.1 肝臟谷胱甘肽酶系統(tǒng) 3.5.2 TBARS指數(shù)3.5.3 SOD活性 3.5.4 CAT指數(shù),,3.5.1 肝臟谷胱甘肽酶系統(tǒng),,3.5.2 TBARS指數(shù),,3.5.3 SOD活性,,3.5.4 CAT指數(shù),,3.6 姜黃素在血清的濃度變化,,3.7 藥動(dòng)學(xué)參數(shù),,4 討論,四氯化碳可以造成肝細(xì)胞損傷，表現(xiàn)為肝小葉中心壞死，肝臟的各種酶系統(tǒng)受到損傷。四氯化碳造成肝臟毒性是因?yàn)榧?xì)胞色素P450酶代謝四氯化碳產(chǎn)生

21、三氯甲基根，三氯甲基根可以引發(fā)一系列級(jí)聯(lián)的自由及反應(yīng)，加速過(guò)氧脂質(zhì)化并使肝臟大部分酶活性降低。研究發(fā)現(xiàn)很多有抗氧化功能的物質(zhì)形成復(fù)合物以后可以有效對(duì)抗四氯化碳引發(fā)的肝損傷。姜黃素可以促進(jìn)膽汁酸的產(chǎn)生和分泌。它還可以加速膽汁的排泄和脂肪代謝物的排泄，從而排泄膽汁中過(guò)多的膽固醇?？赡苁歉闻K加速膽汁的排泄從而使四氯化碳的毒性代謝產(chǎn)物也隨膽汁排除。姜黃素也是一種良好的自由基清除劑，可以提高肝臟清除自由基的能力，從而起到保護(hù)肝臟的作用 脂質(zhì)化的

22、固體藥物口服給藥后其生物利用度是非常低的。引起這種結(jié)果的原因是多方面的，其中最顯著的一個(gè)原因就是由藥物在胃腸道中溶解不完全或溶解緩慢所引起的吸收度差。此種情況，要提高生物利用度就可以通過(guò)改進(jìn)給藥系統(tǒng)而實(shí)現(xiàn)。改進(jìn)后的給藥系統(tǒng)可以提高藥物溶出速率或者增加其在腸胃液中的溶解度。磷脂在這種給藥系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的作用。脂質(zhì)化在增加藥物溶解度方面有著許多的優(yōu)點(diǎn)，并正在嘗試把它作為一種給藥系統(tǒng)。,,在現(xiàn)階段的研究中，我們采用了一種簡(jiǎn)單可重復(fù)的實(shí)驗(yàn)方法

23、來(lái)制備姜黃素磷脂復(fù)合物。其理化性質(zhì)的研究結(jié)果表明姜黃素和磷脂形成了復(fù)合物，增加了藥物的水溶性和正辛醇中的溶解性。新形成的復(fù)合物其抗氧化效果也明顯優(yōu)于單純的姜黃素。姜黃素僅在200mg/kg時(shí)可以抵抗四氯化碳對(duì)肝臟造成的損傷。而磷脂復(fù)合物還可以提高正常機(jī)體的抗氧化酶活性。100mg/kg的姜黃素幾乎不表現(xiàn)處明顯的抗氧化作用，而100mg/kg得磷脂復(fù)合物則表現(xiàn)出明顯的抗氧化活性，并且效果與200mg/kg的姜黃素相當(dāng)。磷脂復(fù)合物200mg