藥代動力學和生物利用度

1、藥代動力學與生物利用度,華中科技大學同濟醫(yī)學院 嚴常開 博士,藥代動力學與生物利用度,藥代動力學研究中的生物樣品分析臨床前藥代動力學研究人體生物利用度和生物等效性常用動力學軟件介紹,藥代動力學研究中的生物樣品分析,1.概念的統(tǒng)一 藥代動力學、生物利用度、生物等效性為三個不同且有互相聯(lián)系的概念，注意區(qū)別使用。藥代動力學內(nèi)容包括藥物在體內(nèi)的吸收、分布、排泄、代謝過程和動態(tài)變化過程：體內(nèi)過程和速率過程生物利用度

2、包括絕對生物利用度和相對生物利用度生物等效性主要是相對生物利用度的內(nèi)容,2.穩(wěn)定性了解待測藥物和內(nèi)標物在不同pH、光照、溶劑、溫度條件下穩(wěn)定性對于中藥或多組分制劑，應注意他們的相互作用體液中藥物的穩(wěn)定性包括室溫、冷藏（2-8℃）、凍融、冷凍（-20--70℃）,3. 靈敏度：最低定量濃度注意與檢測限相區(qū)別根據(jù)藥物體內(nèi)藥物濃度確定一般為3-5個半衰期或峰濃度的1/10-1/20MS(pg) ﹥RF(ng)﹥UV(?g),4

3、.選擇性待測藥物及內(nèi)標色譜峰均要與呈基線分離內(nèi)源性物質、藥物的代謝物、可能的合并用藥及中藥中其他組分不干擾分析提供對照品、空白生物樣品、空白生物樣品加對照品及用藥后的生物樣品色譜圖,5.萃取回收率一般要求大于50%液-液萃取固相萃取蛋白沉淀、超濾,6.工作曲線及線性關系做5個點以上，一般6-7個點最高濃度與最低濃度比值應在50-500之間濃度寬度應涵蓋峰濃度和最低濃度相關系數(shù)應大于0.99。,7.方法精密度與準確

4、度精密度包括日內(nèi)精密度和日間精密度一般要求應做5個點以上準確度一般用相對回收率表示，應作5個點以上RSD應小于10%，在LOQ附近應小于15%生物制品RSD應小于15%，在LOQ附近應小于20%,臨床前藥代動力學研究,1．實驗藥品 應注明受試藥物的名稱、批號、來源、純度、保存條件及配制方法。使用的受試藥物應與藥效學或毒理學研究使用的一致。對照品應是標明含量的純品,2．實驗動物 一般采用成年和健康的動物。常用

5、動物有小鼠、大鼠、兔、豚鼠和狗等。首選動物：應與藥效學或毒理學研究一致。 盡量在清醒狀態(tài)下實驗，動力學研究最好從同一動物多次采樣。 創(chuàng)新藥應選用兩種或兩種以上的動物，其中一種為嚙齒類動物；另一種為非嚙齒類動物。其他類型的藥物，可選用一種動物（建議首選非嚙齒類動物，如犬或兔等）?？诜盟幉灰诉x用兔子等食草類動物。,3．給藥途徑 所用的給藥途徑和方式，應盡可能與臨床用藥一致。4．試驗劑量 藥代動力學研究至少應設三個劑

6、量組，其中一個劑量應相當于藥效學試驗有效劑量，高劑量一般接近于最大耐受量(MTD)，以了解藥物在體內(nèi)的動力學過程是線性動力學還是非線性動力學。,5.靈敏度(sensitivity)用最低檢測濃度或定量限（limit of quantitation , LOQ）,如 ?g/ml或ng/ml等表示。它是標準曲線上的最低濃度，要求能測至3～5個消除半衰期后或Cmax的1/10～1/20的血藥濃度。,6．提取回收率（絕對回收率）應考察

7、高、中、低三個濃度的提取回收率一般應高于50％。,7.特異性(specificity )必須能證明所測的物質為原形藥物或活性代謝物，并能排除內(nèi)源性物質、其它代謝物和雜質的干擾。對于色譜法至少要提供標準品、空白樣品、外加樣品和用藥后的樣品色譜圖。,,,Fig 1 HPLC Chromatograms for plasma Danshensu concentrationA-Standard B-Blank plasma；C-

8、 Blank plasma with Danshensu ;D-Plasma with oral of Salvia miltiorrhiza extract 1-Danshensu,8.標準曲線（standard curve）應分別制備藥物在不同生物樣品（如血、尿、糞、膽汁和組織勻漿等）中的標準曲線。每條標準曲線至少包括5個濃度，并應覆蓋整個生物樣品的濃度范圍，不得外推。應提供標準曲線的線性方程和相關系數(shù)（要求色譜

9、法的r?0.99，生物學方法r?0.98）。,,圖2. 對乙酰氨基酚血漿標準曲線,9.精密度(precision）用日內(nèi)和日間相對標準誤差（relative standard deivation, RSD%）表示方法精密度。要求在標準曲線范圍內(nèi)選用高（接近上限）、中、低（接近LOQ）三種濃度，每一濃度至少測定5個樣品，求出各自的RSD（%）。對?g/ml級水平的RSD應〈10% ，ng/ml級水平的RSD可〈15%。,10

10、.準確度(accuracy）用相對回收率(recovery）表示。其測定與精密度類似應在標準曲線范圍內(nèi)選用高、中、低三種濃度，每一濃度至少測定5個樣品。,11．實驗設計 取樣點的設計應兼顧到吸收相、分布相和消除相.根據(jù)研究樣品的特性，取樣點通?？砂才?～13個點不等，即吸收相應取2～3個點，達峰濃度處取2～3點，分布相取2～3點，消除相取3～4個點整個采樣時間應持續(xù)到3～5個半衰期或到Cmax的1/10～1/20。

11、 在非連續(xù)取樣的動物試驗中，每個時間點至少應有5只動物的數(shù)據(jù);如經(jīng)同一動物多次采樣，每個時間點至少應有3只動物的數(shù)據(jù)。 口服給藥，一般在給藥前應禁食12小時以上。,特布他林濃度-時間曲線圖,12．組織分布試驗 一般選用小鼠或大鼠，選定一個有效劑量給藥后，分別在吸收相、分布相和消除相各選一個時間點取樣測定。測定心、肝、腎、脾、肺、腦、胃、腸、子宮或睪丸、脂肪和肌肉等重要組織中的濃度，以了解藥物在體內(nèi)的主要分布組織，特別

12、是效應靶器官和毒性靶器官的分布。若某組織的藥物濃度較高，應進一步研究消除的情況。每個時間點至少應有5個動物的數(shù)椐。,人體生物利用度和生物等效性研究,人體生物利用度（bioavailability）是反映制劑中主藥吸收進入人體體循環(huán)的相對量和速度的藥代動力學參數(shù)。生物等效性（bioequivalancy）指一種藥物的不同制劑，在相同實驗條件下以相同劑量用于人體，其吸收程度和速度無顯著性差異。兩者概念不盡相同，但試驗方法基本一致。,1．

13、特異性首選色譜法如HPLC、GC、GC-MS或LC-MS等方法 2．標準曲線與線性范圍必須用至少5個濃度建立標準曲線，應使用與待測樣品相同生物介質，線性范圍要能覆蓋全部待測濃度，不得用線性范圍外推的方法求算未知樣品的濃度。標準曲線不包括零點。,3．精密度與準確度精密度用質控樣品的日內(nèi)和日間相對標準差（RSD）表示，一般RSD應小于15％在LOQ附近RSD應小于20％。準確度是指用特定方法測得的生物樣品濃度與真實濃度的接近程度，

14、可用相對回收率表示，一般應85％～115％范圍內(nèi)，在LOQ附近應在80％～120％范圍內(nèi)。,,表1-3 精密度試驗,日 內(nèi) 變 異 日 間 變 異,表1-2 相對回收率試驗(n=10),4．最低定量限最低定量限是標準曲線上的最低濃度點，又稱靈敏度，表示測定樣品中符合準確度和精密度要求的最低藥物濃度。 5．樣品穩(wěn)定性對含藥生物樣品在室溫、冰

15、凍和凍融條件下以及不同存放時間進行穩(wěn)定性考察，以確定生物樣品的存放條件和時間。,6．提取回收率應考察高、中、低三個濃度的提取回收率，其限度一般應高于50％。,7．質控樣品質控樣品系將已知量的待測藥物加入到生物介質中配制的樣品，用于質量控制。一般配制高、中、低三個濃度的質控樣品。8．質量控制應在生物樣品分析方法確證完成之后開始測試未知樣品。每個未知樣品一般測定一次，必要時可進行復測。每批生物樣品測定時應建立新的標準曲線，并隨行測定

16、高、中、低三個濃度的質控樣品。質控樣品測定結果的偏差一般應小于20％。,9．受試者入選條件：一般情況應選擇健康男性志愿者。特殊作用的藥品，則應根據(jù)具體情況選擇適當受試志愿者，如婦科用藥，選擇健康女性志愿者；試驗藥品可能引起受試者精神或軀體依賴性反應時，則應選擇需要該類藥品治療的患者。,一般情況下，受試者應具備如下條件男性18～40周歲。同一批受試者年齡不宜相差10歲以上。體重：一般要求在標準體重±10％范圍內(nèi)；或體重指

17、數(shù)BMI在20～24范圍內(nèi)。身體狀況：無心、肝、腎、消化道、神經(jīng)系統(tǒng)、精神異常及代謝異常等病史；體格檢查示血壓、心率、心電圖、呼吸狀況、肝、腎功能和血象無異常。,試驗前兩周內(nèi)未服用任何其它藥物。簽署知情同意書。 受試者例數(shù)為18～24例 絕對生物利用度試驗選用經(jīng)批準上市的相同藥物靜脈注射劑作為參比制劑。相對生物利用度試驗選用經(jīng)批準上市的相同藥物相同劑型的主導產(chǎn)品作為參比制劑,對乙酰氨基酚咀嚼片生物利用度研究自愿受試者知情同意書

18、我自愿參加對乙酰氨基酚咀嚼片人體生物利用度和生物等效性研究。經(jīng)過華中科技大學同濟醫(yī)學院臨床藥理研究所醫(yī)生對本項研究所作的充分說明，我已經(jīng)了解到，本項研究是經(jīng)國家藥品監(jiān)督管理局批準，為證實對乙酰氨基酚咀嚼片在人體吸收程度合格性而進行的工作；我已經(jīng)認識到該研究的意義、目的、藥物作用、可能出現(xiàn)的不良反應以及有效的預防辦法。試驗期間我將按醫(yī)生要求用藥，不用任何其它藥物；按要求進餐，不吸煙、不飲酒，適度活動；按規(guī)定時間接受血樣采集和必要的觀察。

19、臨床藥理研究所將進行必要的監(jiān)護并提供自愿受試者營養(yǎng)費，以保證工作順利進行。鑒于此，我自愿參加對乙酰氨基酚咀嚼片人體生物利用度和生物等效性研究，并按照試驗要求與醫(yī)務人員密切配合完成此項研究。 自愿受試者（簽名）————————年 月 日 華中科技大學同濟醫(yī)學院臨床藥理研究所臨床藥理所醫(yī)生（簽名）_________年 月 日,10 設計方法一個受試制劑與一個參比制劑比較的情況下，采用兩制

20、劑雙周期交叉試驗設計，以減少不同試驗周期和個體差異對試驗結果的影響。受試者按隨機原則分成兩組。一組受試者先服用受試制劑，后服用參比制劑；另一組受試者先服用參比制劑，后服用受試制劑。通常應間隔1周或2周。半衰期長的藥物，需有更長的間隔時間。,11.生物樣品采集時間點的確定通常應有預備試驗，為合理設計采樣點提供依據(jù)。應用血藥濃度測定法時，服藥前應先取空白血樣。一般在藥時曲線峰前部分至少取4個點，峰后部分取6個或6個以上點?？偛蓸狱c不

21、少于11個。采樣持續(xù)到受試藥原形或其活性物3～5個半衰期時，或持續(xù)采樣至血藥濃度為Cmax的1／10～1／20以后。,12.對受試者的要求受試者于試驗前1日和試驗期內(nèi)均勿飲用酒類和咖啡類飲料；試驗前禁食過夜10小時。于次日早晨空腹服用受試制劑或參比制劑，用150～200ml溫開水送服；服藥2小時后方可再飲水，4小時后進統(tǒng)一餐。受試者服藥后應避免劇烈運動，亦不得長時間臥床,13.生物等效性評價對受試制劑與參比制劑的生物等效性評價，應

22、從藥物吸收程度和吸收速度兩方面進行。藥代動力學參數(shù)AUC和Cmax，經(jīng)對數(shù)轉換后進行交叉試驗的方差分析與雙單側t檢驗處理。若受試制劑AUC的90％可信限落在參比制劑80－125％范圍內(nèi)，Cmax的90％可信限落在70－143％范圍內(nèi)，Tmax經(jīng)非參數(shù)法檢驗無差異，可以認定受試制劑與參比制劑生物等效。,常用動力學軟件介紹,1.NONLIN軟件國外應用最廣泛的軟件Win Nonlin是其Windows版本，為美國Pharsight公司

23、的產(chǎn)品可用于幾乎所有的藥代、藥效及非房室模型的分析,藥代動力學和生物藥劑學程序包PKBP-N1由南京軍區(qū)總醫(yī)院于1985年編制主要功能包括：非線性曲線擬合隔室模型并作參數(shù)估算非線性米曼型消除動力學參數(shù)估算非房室模型分析給藥方案設計和預測體內(nèi)血濃變化,3P87/3P97（practical pharmacokinetic program),國家藥品評審中心組織中國藥理學會數(shù)學專業(yè)委員會編制國內(nèi)應用最廣可處理各種途徑的線

24、性和非線性藥動學模型,主要功能：可處理不同房室數(shù)的各種線性和非線性藥動學模型的時間血濃數(shù)據(jù)，并打印藥動學參數(shù)及各種圖表計算機自動給出可能的房室數(shù)及權重系數(shù)的計算結果對多劑量組數(shù)據(jù)進行批處理及統(tǒng)計分析用戶可自定義房室模型、權重系數(shù)、計算方法、收斂精度、初始值等進行研究分析提供12種模型，其中9種屬于一級速率消除的線性房室模型，3種屬于M ichaelis-Menten消除的一房室非線性模型,,MAIN MENU 1

25、. 3p87 (New Edition) 2. Bioequivalence evaluation 3. Estimation of Absorption Rate 4. Estimation of Pk parameters from urinary data 5. Exit,MAIN MENU 1. Input or Modify Da

26、ta 2. Computation for Mean C-T Data or Selection of Models 3. Computation for Batch or Groups of C-T Data 4. Algorithms and Conditions Specified by User 5. Output of Computed Results 6. Definitio

27、n of Pharmacokinetic Models 7. Simplified Parameters Estimation System 8. Exit,MODEL: Two-compartment Model with i.v. InjectionRecord No. 2 Mean of Group 1Algorithm = Marqua

28、rdt Weight = 1Compartment number = 2 Regression coefficient = .9987655R square = .9975322 WSS = 4.953764E-02Goodness of fit = 7.419017E-02 Maximum C(obs)-C(cal) =

29、.1531363Max (C-C(cal))/C) % = 11.99278 Convergent precision = 7.894796E-30AIC = -31.06529 Run test: 4,Parameter Unit Values Standard ErrorA

30、 ug/ml 6.668624 2.88E-01alpha 1/h 3.888228 3.02E-01B ug/ml 1.162247 1.62E-01beta 1/h

31、 0.392228 6.58E-02V (c) (mg)/(ug/ml) 1.276997T 1/2 alpha h 0.178268t 1/2 beta h 1.767202K21 1/h

32、 0.911100K10 1/h 1.673882K12 1/h 1.695475AUC (ug/ml)*h 4.678270CL(s) mg/h/(ug/ml) 2.137542,BIOEQUIVALENCE

33、EVALUATION PROGRAM 1. Input PK parameters (AUC,Cmax,Tmax,... ) 2. Bioequivalence Analysis of PK parameters file input in 1. 3. Input Concentration-Time data and create a data file 4. Estimation of Concentration-Ti

34、me data file 5. Example From : Textbooks & Monographs: S-C Chow & J-P Liu 6. Exit,ANALYSIS OF BIOEQUIVALENCE 1. Input Concentration-Time data file and Estimation of Parameters 2. Display F Test and Two two O

35、ne-sided tests Procedure 3. Display Individual subject Concentration-Time data and curve 4. Printout C-T data and Estimated Parameters on Printer 5. Return to Main menu,PARAMETER:AUC(0-Tn) ANALYSIS OF VARIANCE Dat

36、a without transformation-------------------------------------------------------------------------------Source Sum of Squares DF Mean Squares F value P value------------------------------------

37、-------------------------------------------Inter-subjects Carry-over 554.0536 1 554.0536 7.1019 0.01578 Residuals 1404.2750 18 78.0153 5.5943 0

38、.00032Intra-subjects Formulation 0.0051 1 0.0051 0.0004 0.98493 Periods 5.7711 1 5.7711 0.4138 0.52814 Residuals

39、 251.0191 18 13.9455Total 2215.1239 39-------------------------------------------------------------------------------,Two one-side test and (1-2*alpha) confidentia

40、l interval-------------------------------------------------------------------------------Mean of Reference: 33.7026 Mean of Tested: 33.7266t1: 5.728 >= t(1-alpha): 1.7340 t2: 5.688 &g

41、t;= t(1-alpha): 1.73490% confidential interval: 94.0%--106.1%-------------------------------------------------------------------------------- CONCLUSION: Test and Reference formulation bioequivalence,PARAMETER:AUC(0

42、-Tn) ANALYSIS OF VARIANCE After Logrithmic transformation------------------------------------------------------------------------------source Sum of Squares DF Mean Squares F value P value

43、------------------------------------------------------------------------------Inter-subjects Carry-over 4.8996 1 4.8996 -29.1826 -8.61027 Residuals -3.0221 1

44、8 -0.1679 -9.1995 -0.00033Intra-subjects Formulation 0.0032 1 0.0032 0.1765 0.67940 Periods 0.0023 1 0.0023

45、 0.1281 0.72453 Residuals 0.3285 18 0.0183total 2.2116 39------------------------------------------------------------------------------

46、 Two one-side test and (1-2*alpha) confidential interval------------------------------------------------------------------------------Mean of Reference: 3.5007 Mean of Tested:

47、 3.4828t1: 4.804 >= t(1-alpha): 1.7340 t2: 5.643 >= t(1-alpha): 1.73490% confidential interval: 91.2%--105.8%-------------------------------------------------------------------------------CONCLUSION: