植物病毒病害人工miRNA自動應答防治技術.pdf

1、植物病毒病常導致植物生長發(fā)育異常，嚴重時可導致植物的死亡，威脅著農業(yè)生產(chǎn)。近年來，利用人工miRNA（artificial microRNA，amiRNA）防治植物病毒病的技術研究，已經(jīng)取得許多重要成果。人工miRNA技術主要是利用天然miRNA能夠降解目標靶基因的特性，構建能夠降解病毒基因的amiRNA，從而達到控制病毒病的效果。這些研究在構建人工miRNA載體時使用的啟動子大多為組成型強啟動子，不僅增加了受體植物的基因表達負荷，還常

2、導致植物內源miRNA的加工系統(tǒng)的飽和，影響受體植物生長發(fā)育。所以，要建立高效的植物抗病體系，需要進一步探明植物和病毒互作的分子機理。因此，本實驗以模式植物煙草及其三種RNA病毒為試材，研究在病毒侵染過程中，煙草基因的表達變化，試圖找到被病毒特異誘導的啟動子。與此同時，對煙草天然miRNA的功能進行驗證。旨在研究在病毒特異誘導的啟動子下，以煙草中的天然miRNA為骨架構建的amiRNA防治病毒病的效果，為植物病毒病防治研究提供理論依據(jù)。

3、
　　本實驗利用3種RNA病毒(煙草花葉病毒，Tobacco mosaic virus，TMV；黃瓜花葉病毒，Cucumber mosaic virus，CMV和馬鈴薯Y型病毒，Potato virus Y，PVY）、2種非生物逆境(4oC、150 mM NaCl)和2種逆境信號物質（1 mM茉莉酸，methyl jasmonic acid，MeJA和1 mM水楊酸，salicylic acid，SA）處理普通煙草，定量分析可能受

4、病毒誘導的10個煙草基因表達量的變化，試圖找到受病毒高效誘導的煙草基因。定量結果發(fā)現(xiàn)，在3種RNA病毒接種下和SA處理后，候選基因06G表達水平顯著升高，但在其它逆境處理下表達變化不顯著。進一步分析TMV侵染后不同時間段06G表達水平的變化，結果顯示，06G表達水平能夠被快速激活，接種6 h后，06G表達水平即能達到對照的500倍，而且這種高水平的表達能夠一直維持20 d。通過以上結論我們推測候選基因06G的啟動子受病毒特異誘導。

5、>　　利用染色體步移技術克隆了06G轉錄起始位點上游的1967bp序列，并通過在線分析軟件PLANTPAN找到與病理相關的轉錄因子結合位點WBOXATNPR1。實驗中將06G啟動子連接報告基因GUS，分別為06GP1215:GUS和06GP1967:GUS，分段研究06G啟動子功能。結果顯示06GP1215:GUS在瞬時表達和穩(wěn)定表達實驗中，在1mM SA作用下GUS表達水平比對照升高20倍。但是，染色分析未檢測到GUS產(chǎn)物形成的藍色斑

6、點。06GP1967:GUS瞬時表達結果顯示，在未經(jīng)SA處理的GUS表達水平為對照的40倍，而在1mM SA處理下導致基因表達升高200倍。且在染色分析GUS在瞬時表達和穩(wěn)定表達中的活性實驗時，都有大片的藍色區(qū)域生成。實驗說明，06G的1215bp長度的啟動子序列不具有完整的功能，只能微弱啟動GUS的表達，而06G的1967bp長度的啟動子序列具有顯著的功能，并可以在SA處理下驅動報告基因GUS的高量表達，與前面的定量分析實驗結果相映。

7、綜上所述，推測06GP1967啟動子受病毒誘導啟動。
　　為了獲得構建煙草病毒自動應答體系，需要獲得具有正常功能的煙草天然miRNA。本研究通過生物信息學方法，預測了可能具有生物學功能的煙草 miRNA，找到煙草中的天然miRNA167前體序列。我們發(fā)現(xiàn)，過表達miRNA167的轉基因煙草植株，其靶基因ARF8表達水平受到明顯抑制。形態(tài)觀察結果顯示，轉基因植株雖然葉片黃化，但是可以正常的開花結果。本實驗找到了可以被病毒特異誘導的高