氨基酸、多肽與蛋白質

1、Biochemistry,張英Tel: 54237663E-mail: yingz@shmu.edu.cn,Welcome to,緒 論,Biochemistry: Neuberg ,1903Chemistry of life,,運用化學和物理學及生物學原理和技術，主要是化學原理來研究生命現象的學科。生物化學研究的最終目的是在分子水平揭示生命活動的本質，以及致病機制和治療原理。,一 、生物化學的內容,1.敘述生化： 組

2、成與結構2.動態(tài)生化： 代謝與調控3.功能生化： 結構與功能,1. 敘述生化：組成與結構,生物體組成分（%） ： 水 蛋白質 脂類 無機鹽 糖類 核酸55-67 15-18 10-15 3-4 1-2 微量三大營養(yǎng)素：

3、 蛋白質 脂類 糖類,2. 動態(tài)生化： 代謝與調控,代謝：生物體與環(huán)境的物質交換 體現生命 維持生命調控：為適應環(huán)境的變化而改變代謝的機制,,,糖，蛋白質，脂肪：氧化產生ATP核酸，膽固醇，磷脂，維生素：參與機體結構和功能,3. 功能生化： 結構與功能,細胞水平和分子水平各異的生命決定于各異的結構不同的功能具有不同的結構,分子生物學 蛋白

4、質的結構與功能 核酸的結構與功能,二、 生物化學的重要性,重要性在于生物化學的應用性三多: 每年發(fā)表論文 諾貝爾獎獲得者 生化科學家生物學的普通語言──世界語言基礎醫(yī)學的關鍵學科,三、 生物化學的學習方法,1.代謝通路與酶相聯系2.前后內容對照學3.整體內容貫穿起來再復習,三難：體內參與反應的物質多，記憶難代謝反應途徑多，功能各異，入門難大分子的結構與功能之間的關系

5、復雜，理解難,課程學習安排,本學期：生物化學（一）內容：大分子結構與功能 三大代謝 肝膽生化,下學年第一學期：生物化學（二）內容：遺傳信息的流動、生物信息的傳導雙語教學*,課程進度表網址：http://shmc.shmu.edu.cn/jxjd/,參考書,Harper’s Biochemistry 26th ed.Murray et al,2003Lehninger Principl

6、es of Biochemistry,4th ed.Dalid et al,2005Biochemistry，3rd ed.Donald Voet et al, 2003王鏡巖主編：《生物化學》3版，2002，高等教育出版社,氨基酸、多肽與蛋白質,第四章,Amino Acids，Peptides and Proteins,,1833年，Payen和Persoz分離出淀粉酶。1864年，Hoppe-Seyler從血液分離出血紅蛋白，

7、并將其制成結晶。19世紀末，Fischer證明蛋白質是由氨基酸組成的，并用氨基酸合成了多種短肽 。 1938年，德國化學家Gerardus J. Mulder引用“Protein” 一詞來描述蛋白質。,,,,1951年, Pauling采用X（射）線晶體衍射發(fā)現了蛋白質的二級結構——α-螺旋(α-helix)。 1953年，Frederick Sanger完成胰島素一級序列測定。 1962年，John Kendrew和Max

8、Perutz確定了血紅蛋白的四級結構。20世紀90年代以后，后基因組計劃。,什么是蛋白質?,蛋白質（protein）是由許多氨基酸（amino acids）通過肽鍵（peptide bond） 相連形成的大分子含氮化合物。,分布廣：所有器官、組織都含有蛋白質；細胞的各個部分都含有蛋白質。含量高：蛋白質是細胞內最豐富的有機分子，占人體干重的45％，某些組織含量更高，例如脾、肺及橫紋肌等高達80％。,蛋白質的生物學重要性,1. 蛋白質是

9、生物 體重要組成成分,1）作為生物催化劑（酶）2）代謝調節(jié)作用3）免疫保護作用4）物質的轉運和存儲5）運動與支持作用6）參與細胞間信息傳遞,2. 蛋白質具有重要的生物學功能,3. 氧化供能,氨基酸,第一節(jié),Amino Acids,一、組成人體的20種氨基酸均屬于L-α-氨基酸,存在自然界中的氨基酸有300余種，但組成人體蛋白質的氨基酸僅有20種，且均屬 L-氨基酸（甘氨酸除外）。,,H,氨基酸分類,疏水性氨基酸極性氨

10、基酸,中性氨基酸酸性氨基酸堿性氨基酸,脂肪族氨基酸芳香族氨基酸,(一)側鏈含烴鏈的氨基酸屬于非極性脂肪族氨基酸,二、20種氨基酸的側鏈結構及極性迥然不同,此類氨基酸有丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸和脯氨酸。此類氨基酸在水溶液中溶解度小。,氨基酸分類（一）,,中性氨基酸有甘氨酸、絲氨酸、半胱氨酸、蘇氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。,氨基酸分類（二）,(三)側鏈含芳香基團的氨基酸是芳香族氨基酸,此類氨基酸有苯丙氨酸、酪氨酸和色

11、氨酸，其側鏈分別有苯基、酚基和吲哚基。,氨基酸分類（三）,,(四)側鏈含負性解離基團的氨基酸是酸性氨基酸,此類氨基酸有天冬氨酸、谷氨酸，其側鏈都含有羧基，均可解離而帶負電荷。,氨基酸分類（四）,(五)側鏈含正性解離基團的氨基酸屬于堿性氨基酸,此類氨基酸有賴氨酸、精氨酸和組氨酸，其側鏈分別含有氨基、胍基和咪唑基，均可發(fā)生質子化，使之帶正電荷。,氨基酸分類（五）,幾種特殊氨基酸,脯氨酸（亞氨基酸）,? 半胱氨酸,胱氨酸,修飾性氨基酸,羥

12、賴氨酸HO-Lys羥脯氨酸HO-Pro蘇氨酸、絲氨酸、酪氨酸磷酸化絲氨酸糖基化天冬酰胺糖基化,三、20種氨基酸具有共同或特異的理化性質,（一）氨基酸具有兩性解離性質,氨基酸是兩性電解質，其解離程度取決于所處溶液的酸堿度。,pH=pI,pH>pI,pH<pI,氨基酸的兼性離子,陽離子,陰離子,等電點 (isoelectric point, pI),在某一pH的溶液中，氨基酸解離成陽離子和陰離子的趨勢及程度相等，成為兼性

13、離子，呈電中性。此時溶液的pH值稱為該氨基酸的等電點。,（二） 氨基酸具有特征性的滴定曲線,甘氨酸滴定曲線,（三）含共軛雙鍵的氨基酸具有紫外吸收性質,色氨酸、酪氨酸的最大吸收峰在 280nm 附近。,大多數蛋白質含有這兩種氨基酸殘基，所以測定蛋白質溶液280nm的光吸收值是分析溶液中蛋白質含量的快速簡便的方法。,芳香族氨基酸的紫外吸收,（四） α-氨基參與多種化學反應,Schiff堿,醛,氨基酸,（五）氨基酸的α-氨基與α-羧基共同參與

14、茚三酮反應,氨基酸與茚三酮水合物共熱，可生成藍紫色化合物，其最大吸收峰在570nm處。由于此吸收峰值與氨基酸的含量存在正比關系，因此可作為氨基酸定量分析方法。,（六）一個氨基酸的羧基可與另一個氨基酸的氨基反應成肽,氨基酸的?-羧基與另一個氨基酸的?-氨基脫水縮合而生成二肽，多個氨基酸縮合生成多肽。,多肽和蛋白質Polypeptides and Proteins,第二節(jié),一、多肽和蛋白質是氨基酸的多聚體,（一）氨基酸是多肽與蛋白質的基本

15、組成單位,氨基酸通過肽鍵(peptide bond) 相互連接而形成多肽和蛋白質。肽鍵是由一個氨基酸的?-羧基與另一個氨基酸的?-氨基脫水縮合而形成的化學鍵。,+,,,甘氨酰甘氨酸,肽鍵,* 肽是由氨基酸通過肽鍵縮合而形成的化合物。,* 兩分子氨基酸縮合形成二肽，三分子氨基酸縮合則形成三肽……,* 肽鏈中的氨基酸分子因為脫水縮合而基團不全，被稱為氨基酸殘基(residue)。,* 由十個以內氨基酸相連而成的肽稱為寡肽(oligopep

16、tide)，由更多的氨基酸相連形成的肽稱多肽(polypeptide)。,氨基末端（amino terminal）或 N 末端：多肽鏈中有自由氨基的一端羧基末端（carboxyl terminal）或C 末端：多肽鏈中有自由羧基的一端,多肽鏈有方向性：,* 多肽鏈(polypeptide chain)是指許多氨基酸之間以肽鍵連接而成的一種結構。,多肽鏈從氨基末端走向羧基末端。,N末端,C末端,牛核糖核酸酶,（二）體內存在多種重要的生物

17、活性肽,1.谷胱甘肽是體內重要的還原劑,谷胱甘肽(glutathione, GSH),GSH過氧化物酶,GSH還原酶,NADPH+H+,NADP+,2.體內有許多激素屬寡肽或多肽,3. 神經肽是腦內一類重要的肽,在神經傳導過程中起重要作用的肽類稱為神經肽(neuropeptide)。,? 組成蛋白質的元素：,主要有C、H、O、N和S。有些蛋白質含有少量磷或金屬元素鐵、銅、鋅、錳、鈷、鉬，個別蛋白質還含有碘 。,二、蛋白質的分子組成和

18、結構極其復雜,各種蛋白質的含氮量很接近，平均為16％。,由于體內的含氮物質以蛋白質為主，因此，只要測定生物樣品中的含氮量，就可以根據以下公式推算出蛋白質的大致含量：,100克樣品中蛋白質的含量 ( g % )= 每克樣品含氮克數× 6.25×100,1/16%,? 蛋白質元素組成的特點：,(一)蛋白質根據分子組成分為單純蛋白質和結合蛋白質兩類,根據蛋白質組成成分，可分為：,結合蛋白質及其輔基,根據蛋白質形狀，可

19、分為：,根據蛋白質結構與功能的關系，可分為：,超家族（super family）家族（family）亞家族（subfamily）,,形狀決定性質,(二)蛋白質分子結構可區(qū)分為4個層次,,高級結構或空間構象(conformation),一級結構(primary structure)二級結構(secondary structure)三級結構(tertiary structure)四級結構(quaternary structu

20、re),三、氨基酸殘基的排列順序決定蛋白質的一級結構,肽鍵（主要化學鍵）二硫鍵,蛋白質一級結構(primary structure)是指蛋白質分子中，從N端到C端的氨基酸排列順序。形成一級結構的化學鍵：,一級結構是蛋白質空間構象和特異生物學功能的基礎，但不是決定蛋白質空間構象的唯一因素。,,,,,目 錄,胰島素空間結構,四、多肽鏈中的局部特殊構象是蛋白質的二級結構,蛋白質二級結構(secondary structure)是指蛋白質分

21、子中某一段肽鏈的局部空間結構，即該段肽鏈主鏈骨架原子的相對空間位置，并不涉及氨基酸殘基側鏈的構象 。,?-螺旋 ( ? -helix ) ?-折疊 ( ?-pleated sheet ) ?-轉角 ( ?-turn ) 無規(guī)卷曲 ( random coil ),蛋白質二級結構的主要形式：,維系二級結構的主要化學鍵： 氫鍵,（一）肽鍵是一個剛性的平面,參與肽鍵的6個原子C?1、C、O、N、H、C?2位于同一平面，C?1和C

22、?2在平面上所處的位置為反式(trans)構型，此同一平面上的6個原子構成了所謂的肽單元 (peptide unit) 。,（二）?-螺旋是常見的蛋白質二級結構,α-螺旋,連續(xù)排列的酰胺平面旋轉形成面螺旋右手螺旋酰胺平面與螺旋的長軸平行一個AA0.15nm,每3.6個為一圈(0.54nm)螺旋借助相鄰兩圈之-NH---CO-穩(wěn)定AA的側鏈伸向螺旋外側AA的大小和電荷可以影響螺旋的形成,（三）?-折疊使多肽鏈形成片層結構,,,

23、β-折疊,較為伸展,酰胺平面以鋸齒狀排列兩個片段可以是平行或反平行AA間距 平行 0.65nm 反平行 0.67nm只有片段間氫鍵,無片段內氫鍵AA的側鏈伸向鋸齒狀結構的外側小側鏈的AA有利于β-折疊的生成,（四）?-轉角和無規(guī)卷曲在蛋白質分子中普遍存在,?-轉角,無規(guī)卷曲是用來闡述沒有確定規(guī)律性的那部分肽鏈結

24、構。,,（五）模體是蛋白質的超二級結構,在許多蛋白質分子中，可發(fā)現二個或三個具有二級結構的肽段，在空間上相互接近，形成一個特殊的空間構象，并發(fā)揮專一的功能 ，被稱為模體(motif)。,超二級結構：2個或2個以上二級結構組合， αα，βαβ，ββ,模體(motif)： 數個至數

25、十個AA組成的具有自身相對獨立構象和功能的小區(qū)域，模體可構成結構域，也可獨立存在。,,鈣結合蛋白中結合鈣離子的模體,鋅指結構(zinc finger),各種蛋白激酶：以ATP為底物，其ATP結合模體相同。氨基酰~tRNA合成酶也以ATP為底物，其ATP結合模體與上大不相同。,幾種蛋白激酶C的模體,PS CRR1 CRR2 CaBS ABS DFG PBS

26、 21 22 207 23 305? H2N-RKGALR--CX2CX13CX2CX2VX41CX2CX13CX2CX2N----------■-----------COOH 21 22

27、 210 23 301/3 ?I/?Ⅱ H2N-RKGALR--CX2CX13CX2CX2VX41CX2CX13CX2CX2N----------■-----------COOH 21 22 219 23 310? H2N-RKGAL

28、R--CX2CX13CX2CX2VX41CX2CX13CX2CX2N----------■-----------COOH 143 22 86 23 298? H2N------RRGAIK--CX2CX13CX2CX2AX48CX2CX13CX2CX2N-----■-----------COOH

29、 155 21 135 23 301? H2N-------RQGAVR--CX2CX14CX2CX2VX48CX2CX13CX2CX2N--------■-----------COOH 15 22 91 23

30、 312? H2N-RRGARR--CX2CX13CX2CX2L-----■-----------COOH,幾種蛋白激酶C的模體,PS：假底物模體 RKGALR ，用于阻斷酶活性中心與底物的結合。 真底物 RXXSXRCRR1、CRR2：富含Cys，與激活劑結合，如：DG、PMA等。CaBS：鈣結合位點，受鈣離子調節(jié)ABS：

31、ATP結合模體DFG： Asp-Phe-Gly催化位點PBS：蛋白質結合模體,,唾液酸轉移酶：50AA唾液酰模體，與底物CMP-SA結合。半乳糖轉移酶：CX5-6K(R)DKKND(G)，底物UDP-Gal 結合模體。弗林蛋白酶：定位于TGN，或細胞膜及胞外基質，通過胞飲回TGN，有二個模體。 四肽模體：與胞飲有關，YKGL,不

32、同生物完全保守，普遍存在于通過胞飲作用循環(huán)于胞膜及高爾基體的膜蛋白上。 酸性膜體：膜上定位，CPSDSEEDEG,也存在于某些膜蛋白中?？赡芘c在膜上的定位有關。,模體與功能,相同的模體表現出相同的功能，因此，不同蛋白質只要有部分相似功能就可能具有相似的膜體。具有不同功能的蛋白質其模體不同，即使是同一類蛋白質也表現出

33、不同的性質。,（六）氨基酸殘基的側鏈可影響二級結構的形成,蛋白質二級結構是以一級結構為基礎的。一段肽鏈其氨基酸殘基的側鏈適合形成?-螺旋或β-折疊，它就會出現相應的二級結構。這是氨基酸殘基的側鏈的相互作用可穩(wěn)定或去穩(wěn)定相應的二級結構的原因。,一段肽鏈有多個酸性氨基酸殘基相鄰，則在pH7.0時這些殘基的游離羧基都帶負電荷，彼此相斥，妨礙α-螺旋的形成。同樣，多個堿性氨基酸殘基在一肽段內，由于正電荷相斥，也妨礙α-螺旋的形成。,天冬酰胺、

34、亮氨酸的側鏈很大，也會影響α-螺旋形成。,脯氨酸的結構不利于形成α-螺旋。,形成β-折疊的肽段要求氨基酸殘基的側鏈較小，才能容許兩條肽段彼此靠近。,五、多肽鏈在二級結構基礎上進一步折疊形成蛋白質三級結構,蛋白質的三級結構(tertiary structure)是指整條肽鏈中全部氨基酸殘基的相對空間位置。即肽鏈中所有原子在三維空間的排布位置。,（一）三級結構是指整條多肽鏈的空間分布,肌紅蛋白 (Mb) 的三級結構,,153 AA1 He

35、meA~H八段α-螺旋無-S-S-鍵功能：儲存O2,(二) 維持三級結構穩(wěn)定主要依靠非共價鍵,蛋白質三級結構的形成和穩(wěn)定主要靠弱的相互作用力或稱非共價鍵、次級鍵，主要有氫鍵、 Van der Waals力、疏水作用、和離子鍵等。,纖連蛋白分子的結構域,（三）三級結構可含有功能各異的結構域,大分子蛋白質的三級結構?？煞指畛梢粋€或數個球狀或纖維狀的區(qū)域，折疊得較為緊密，各行使其功能，稱為結構域(domain) 。,3-磷酸甘油醛脫氫酶

36、,(四) 根據結構域可對蛋白質進行分類,根據結構域可將球狀蛋白質分為4類：反平行α螺旋結構域（全α-結構）平行或混合型β折疊片結構域（α，β-結構）反平行β折疊片結構域(全β-結構)富含金屬或二硫鍵結構域（不規(guī)則小蛋白質結構）,A. 全α-結構域 B. 平行或混合型β折疊片結構域C. 全β-結構域 D. 富含二硫鍵結構域,催化結構域：功能相近者相似調節(jié)結構域：調節(jié)因子不同，故相似者甚少。結構域的存在可很

37、好解釋多功能酶的作用機制。不同酶分子上存在著不同的結構域，故功能不同。相同的結構域存在于不同酶分子上，可推測其具有部分相同功能。,結構域與功能,蛋白激酶,PKA PKG PKC EGFR 肌球蛋白 同源性 輕鏈激酶催化亞基 C

38、側催化域 N側催化域 +調節(jié)亞基 N側調節(jié)域 C側調節(jié)域 ATP結合區(qū)段，Asp-Phe-Gly催化位點，蛋白質底物結合位點,,,乙酰CoA羧化酶,生物素羧基結合蛋白生物素羧化酶羧基轉移酶別構調節(jié)中心,乙酰轉移酶 轉酰基酶

39、 ? ?酮脂酰合成酶 ??酮脂酰還原酶? ?羥脂酰脫水酶 ?,? ?烯脂酰還原酶

40、 硫脂酶7個結構域構成24萬大分子，以二分子聚合才能催化反應,脂肪酸合成酶,,結構域與功能,功能相近者具有相似的結構域不同結構域具有不同功能多功能要求多結構域,（五）分子伴侶參與蛋白質的折疊,分子伴侶(chaperone)通過提供一個保護環(huán)境從而加速蛋白質折疊成天然構象或形成四級結構。,* 分子伴侶可逆地與未折疊肽段的疏水部分結合隨后松開，如此重復進行可防止錯誤的聚集發(fā)生，使肽鏈正確折疊。,* 分子伴侶也可

41、與錯誤聚集的肽段結合，使之解聚后，再誘導其正確折疊。,* 分子伴侶對于蛋白質分子折疊過程中二硫鍵的正確形成起了重要的作用。,伴侶蛋白在蛋白質折疊中的作用,亞基之間的結合力主要是疏水作用，其次是氫鍵和離子鍵。,六、某些蛋白質具有四級結構形式,蛋白質分子中各亞基的空間排布及亞基接觸部位的布局和相互作用，稱為蛋白質的四級結構。,有些蛋白質分子含有二條或多條多肽鏈，每一條多肽鏈都有完整的三級結構，稱為蛋白質的亞基 (subunit)。,血紅蛋白

42、的四級結構,（二）亞基通過亞基間的相互作用聯系在一起,由2個亞基組成的蛋白質四級結構中，若亞基分子結構相同，稱之為同二聚體(homodimer)，若亞基分子結構不同，則稱之為異二聚體(heterodimer)。,（三）生物體內有很多由多亞基組成的蛋白質,生物體內許多蛋白質往往由多個亞基組成，亞基之間憑借次級鍵形成蛋白質四級結構。,胰島素受體：由4個亞基組成(α2β2) ，α亞基與β亞基形成單體(monomer)，2個單體形成二聚體(di

43、mer)。,血紅蛋白的一、二、三、四級結構,蛋白質結構與功能的關系Structure and Function of Proteins,第三節(jié),（一）一級結構是空間構象的基礎,一、一級結構是高級結構與功能的基礎,天然狀態(tài)，有催化活性,尿素、 β-巰基乙醇,,去除尿素、β-巰基乙醇,非折疊狀態(tài)，無活性,,（二）一級結構相似的蛋白質具有相似的高級結構與功能,一級結構相似的多肽或蛋白質，其空間構象以及功能也相似。,────────────

44、──────────── 氨基酸殘基序號 胰島素 ─────────────── A5 A6 A10 B30──────────────────────── 人

45、 Thr Ser Ile Thr 豬 Thr Ser Ile Ala 狗 Thr Ser Ile Ala 兔

46、 Thr Gly Ile Ser 牛 Ala Gly Val Ala 羊 Ala Ser Val Ala 馬 Thr Ser

47、 Ile Ala────────────────────────,促腎上腺皮質激素(ACTH)和促黑激素(α-MSH, β-MSH)共有一段相同的氨基酸序列，因此，ACTH也可促進皮下黑色素生成但作用較弱。,(三)氨基酸序列提供重要的生物化學信息,一些廣泛存在于生物界的蛋白質如細胞色素c(cytochrome c)，比較它們的一級結構，可以幫助了解物種進化間的關系。,從細胞色素c的一級結構看生物進化

48、物種進化過程中越接近的生物，細胞色素的一級結構越相似,（四）重要蛋白質氨基酸序列的改變可引起疾病,例：鐮刀形紅細胞貧血,這種由蛋白質分子發(fā)生變異所導致的疾病，稱為“分子病”。,1. 肌紅蛋白/血紅蛋白含有血紅素輔基,二、蛋白質空間結構表現功能,血紅素結構,(一)血紅蛋白構象改變引起功能變化,肌紅蛋白(myoglobin，Mb),肌紅蛋白是一個只有三級結構的單鏈蛋白質，有8段α-螺旋結構。血紅素分子中的兩個丙酸側鏈以離子鍵形式與肽鏈中的

49、兩個堿性氨基酸側鏈上的正電荷相連，加之肽鏈中的F8組氨酸殘基還與Fe2+形成配位結合，所以血紅素輔基與蛋白質部分穩(wěn)定結合。,血紅蛋白(hemoglobin，Hb),血紅蛋白具有4個亞基組成的四級結構。Hb各亞基的三級結構與Mb極為相似。Hb亞基之間通過8對鹽鍵，使4個亞基緊密結合而形成親水的球狀蛋白。,Hb與Mb一樣能可逆地與O2結合， Hb與O2結合后稱為氧合Hb。氧合Hb占總Hb的百分數（稱百分飽和度, pO2 ）隨O2濃度變化而

50、改變。,2. 血紅蛋白的構象變化影響結合氧的能力,肌紅蛋白(Mb)和血紅蛋白(Hb)的氧解離曲線,Hb與Mb的氧飽和曲線氧合Hb (Mb)與pO2的關系 Hb ：S狀曲線 Mb ：直角雙曲線 S狀曲線提供了一個靈敏可調的范圍(低pO2)和一個平坦不可調的范圍(高pO2)。,意義：肺部pO2較高，在一定范圍內變化時，不至于太大地影響氧飽和度。(80-100)組織 pO2 較低，略有變 化，即可獲得飽和度的

51、變化，充分地獲氧。(20-40mmHg),結構與功能的關系 一級結構決定構象 空間構象決定功能：?, ?亞基與Mb的三級結構相似，結合O2。不同來源的Hb其三,四級結構相似,運輸O2Hb：四亞基，運輸O2Mb：單亞基，儲存O2,X射線衍射圖： Hb與HbO2構象不同 定義：某些因素作用于蛋白質時，可結合至蛋白質的某一部位，而使此蛋白質構象發(fā)生改變，從而調節(jié)該蛋白質的活性。Hb：別位蛋白O2：別位效應劑

52、別位效應具有普遍性,別位效應(allosteric effect),協同效應(cooperativity),一個寡聚體蛋白質的一個亞基與其配體結合后，能影響此寡聚體中另一個亞基與配體結合能力的現象，稱為協同效應。 如果是促進作用則稱為正協同效應 (positive cooperativity)如果是抑制作用則稱為負協同效應 (negative coopera

53、tivity),,,血紅素與氧結合后，鐵原子半徑變小，就能進入卟啉環(huán)的小孔中，繼而引起肽鏈位置的變動。,（二）蛋白質構象改變可導致構象病,蛋白質構象疾病：若蛋白質的折疊發(fā)生錯誤，盡管其一級結構不變，但蛋白質的構象發(fā)生改變，仍可影響其功能，嚴重時可導致疾病發(fā)生。,蛋白質構象改變導致疾病的機制：有些蛋白質錯誤折疊后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉樣纖維沉淀，產生毒性而致病，表現為蛋白質淀粉樣纖維沉淀的病理改變。,這類疾病包括：人紋狀體脊髓

54、變性病、老年癡呆癥、亨丁頓舞蹈病、瘋牛病等。,瘋牛病是由朊病毒蛋白(prion protein, PrP)引起的一組人和動物神經退行性病變。正常的PrP富含α-螺旋，稱為PrPc。PrPc在某種未知蛋白質的作用下可轉變成全為β-折疊的PrPsc，從而致病。,瘋牛病,第四節(jié),蛋白質的理化性質Chemical and Physical Properties of Proteins,,一、蛋白質具有兩性電離性質,蛋白質分子除兩端的氨基和

55、羧基可解離外，氨基酸殘基側鏈中某些基團，在一定的溶液pH條件下都可解離成帶負電荷或正電荷的基團。,當蛋白質溶液處于某一pH時，蛋白質解離成正、負離子的趨勢相等，即成為兼性離子，凈電荷為零，此時溶液的pH稱為蛋白質的等電點。,蛋白質的等電點( isoelectric point, pI),二、蛋白質具有膠體性質,蛋白質屬于生物大分子之一，分子量可自1萬至100萬之間，其分子的直徑可達1～100nm，為膠粒范圍之內。,蛋白質膠體穩(wěn)定的因素：

56、顆粒表面電荷水化膜,水化膜,溶液中蛋白質的聚沉,三、很多因素可引起蛋白質變性,在某些物理和化學因素作用下，其特定的空間構象被破壞，也即有序的空間結構變成無序的空間結構，從而導致其理化性質改變和生物活性的喪失。,蛋白質的變性(denaturation),造成變性的因素,如加熱、乙醇等有機溶劑、強酸、強堿、重金屬離子及生物堿試劑等 。,應用舉例臨床醫(yī)學上，變性因素常被應用來消毒及滅菌。此外, 防止蛋白質變性也是有效保存蛋白質制劑（如

57、疫苗等）的必要條件。,若蛋白質變性程度較輕，去除變性因素后，蛋白質仍可恢復或部分恢復其原有的構象和功能，稱為復性 。,蛋白質的復性(renaturation),天然狀態(tài)，有催化活性,尿素、 β-巰基乙醇,,去除尿素、β-巰基乙醇,非折疊狀態(tài)，無活性,,在一定條件下，蛋白疏水側鏈暴露在外，肽鏈融會相互纏繞繼而聚集，因而從溶液中析出。變性的蛋白質易于沉淀，有時蛋白質發(fā)生沉淀，但并不變性。,蛋白質變性后的絮狀物加熱可變成比較堅固的凝塊，

58、此凝塊不易再溶于強酸和強堿中。,蛋白質沉淀,蛋白質的凝固作用(protein coagulation),四、蛋白質在紫外光譜區(qū)有特征性吸收峰,由于蛋白質分子中含有共軛雙鍵的酪氨酸和色氨酸，因此在280nm波長處有特征性吸收峰。蛋白質的OD280與其濃度呈正比關系，因此可作蛋白質定量測定。,五、蛋白質呈色反應可用于溶液蛋白質測定,（一）蛋白質經水解后產生茚三酮反應,蛋白質經水解后產生的氨基酸也可發(fā)生茚三酮反應(ninhydrin reac

59、tion) 。,（二）肽鏈中的肽鍵可與雙縮脲試劑反應,蛋白質和多肽分子中肽鍵在稀堿溶液中與硫酸銅共熱，呈現紫色或紅色，此反應稱為雙縮脲反應(biuret reaction) 。雙縮脲反應可用來檢測蛋白質水解程度。,蛋白質的分離、純化與序列分析Isolation, Purification and Sequencing of Proteins,第五節(jié),一、透析及超濾法可清除蛋白質溶液中的小分子化合物,,利用透析袋把大分子蛋白質與小分

60、子化合物分開的方法。,應用正壓或離心力使蛋白質溶液透過有一定截留分子量的超濾膜，達到濃縮蛋白質溶液的目的。,超濾法,透析(dialysis),二、丙酮沉淀、鹽析及免疫沉淀是常用的蛋白質沉淀方法,使用丙酮沉淀時，必須在0～4℃低溫下進行，丙酮用量一般10倍于蛋白質溶液體積。蛋白質被丙酮沉淀后，應立即分離。除了丙酮以外，也可用乙醇沉淀。,鹽析(salt precipitation)是將硫酸銨、硫酸鈉或氯化鈉等加入蛋白質溶液，使蛋白質表面電荷

61、被中和以及水化膜被破壞，導致蛋白質沉淀。,將某一純化蛋白質免疫動物可獲得抗該蛋白的特異抗體。利用特異抗體識別相應的抗原蛋白，并形成抗原抗體復合物的性質，可從蛋白質混合溶液中分離獲得抗原蛋白。,免疫沉淀法（immunoprecipitation）,三、利用電荷性質可將蛋白質采用電泳法進行分離,蛋白質在高于或低于其pI的溶液中為帶電的顆粒，在電場中能向正極或負極移動。這種通過蛋白質在電場中泳動而達到分離各種蛋白質的技術, 稱為電泳(elct

62、rophoresis) 。根據支撐物的不同，可分為薄膜電泳、凝膠電泳等。,SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，常用于蛋白質分子量的測定。等電聚焦電泳，通過蛋白質等電點的差異而分離蛋白質的電泳方法。雙向凝膠電泳，蛋白質組學研究的重要技術。,幾種重要的蛋白質電泳：,四、應用相分配或親和原理可將蛋白質進行層析分離,待分離蛋白質溶液（流動相）經過一個固態(tài)物質（固定相）時，根據溶液中待分離的蛋白質顆粒大小、電荷多少及親和力等，使待分離的蛋白質組分在

63、兩相中反復分配，并以不同速度流經固定相而達到分離蛋白質的目的 。,層析(chromatography),離子交換層析：利用各蛋白質的電荷量及性質不同進行分離。凝膠過濾(gel filtration)又稱分子篩層析，利用各蛋白質分子大小不同分離。,蛋白質分離常用的層析方法,五、利用蛋白質顆粒沉降行為不同可進行超速離心分離,超速離心法(ultracentrifugation)既可以用來分離純化蛋白質也可以用作測定蛋白質的分子量。,蛋白質在

64、離心場中的行為用沉降系數(sedimentation coefficient, S)表示,沉降系數與蛋白質的密度和形狀相關 。,因為沉降系數S大體上和分子量成正比關系，故可應用超速離心法測定蛋白質分子量，但對分子形狀的高度不對稱的大多數纖維狀蛋白質不適用。,S,六、用化學或反向遺傳學方法可分析或演繹多肽鏈的氨基酸序列,分析已純化蛋白質的氨基酸殘基組成（離子交換層析）,測定多肽鏈的氨基末端與羧基末端為何種氨基酸殘基,把肽鏈水解成片段，分別

65、進行分析,測定各肽段的氨基酸排列順序，一般采用Edman降解法,一般需用數種水解法，并分析出各肽段中的氨基酸順序，然后經過組合排列對比，最終得出完整肽鏈中氨基酸順序的結果。,,,,,,氨基酸和肽的末端測定法,,通過核酸來推演蛋白質中的氨基酸序列：,按照三聯密碼的原則推演出氨基酸的序列,分離編碼蛋白質的基因,測定DNA序列,排列出mRNA序列,,,,七、應用物理學、生物信息學原理可進行蛋白質空間結構測定或預測,通常采用圓二色光譜(circ

66、ular dichroism，CD)測定溶液狀態(tài)下的蛋白質二級結構含量。 ?-螺旋的CD峰有222nm處的負峰、208nm處的負峰和198nm處的正峰三個成分；而?-折疊的CD譜不很固定。,二級結構測定,三維空間結構測定X射線衍射法(X-ray diffraction)和核磁共振技術(nuclear magnetic resonance, NMR)是研究蛋白質三維空間結構最準確的方法。,* 用分子力學、分子動力學的方法，根據物理化學