急性毒性試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1、急性毒性試驗(yàn)設(shè)計(jì),組員：程旺、高思杰、后若蘭 高陽(yáng)、陳剛,一、急性毒性,急性毒性指人或動(dòng)物一次或24 h之內(nèi)多次接觸外源化學(xué)物后，在短期內(nèi)所發(fā)生的毒性效應(yīng)，包括致死效應(yīng)。,一次：指瞬間給實(shí)驗(yàn)動(dòng)物染毒，如經(jīng)口、經(jīng)靜脈注射染毒。24 h之內(nèi)多次：指外源化學(xué)物毒性過(guò)低，需給予動(dòng)物較大劑量。,急性毒性效應(yīng)出現(xiàn)的快慢和毒性反應(yīng)的強(qiáng)度與外源化學(xué)物的性質(zhì)和染毒劑量的大小有關(guān)。 如：丙烯腈，過(guò)氧化二碳酸二環(huán)己酯,

2、丙烯腈經(jīng)口急性毒性試驗(yàn)設(shè)計(jì),實(shí)驗(yàn)?zāi)康?評(píng)價(jià)丙烯腈的毒性作用，求出半數(shù)致死量LD50，并根據(jù)LD50進(jìn)行急性毒性分級(jí)，掌握實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分組的方法和經(jīng)口灌胃的技術(shù)。觀察丙烯腈急性中毒癥狀；為后續(xù)試驗(yàn)提供依據(jù)；為毒理學(xué)機(jī)制研究提供線索。,器材與試劑,1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 ICR小鼠（健康成年小鼠）2、實(shí)驗(yàn)器材 灌胃針、注射器、吸管、容量瓶、燒杯、滴管、電子天平、動(dòng)物體重秤、外科剪刀、鑷子 3、實(shí)驗(yàn)試劑 丙烯腈、苦味酸酒精飽和液、伊紅染液,

3、實(shí)驗(yàn)方法,1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇2、劑量設(shè)計(jì)及隨機(jī)化分組3、受試物的配制4、染毒途徑的選擇5、毒性反應(yīng)的觀察與LD50的計(jì)算6、急性毒性的評(píng)價(jià),1、物種和品系 對(duì)外源化學(xué)物毒性反應(yīng)與人近似易于飼養(yǎng)管理 方便實(shí)驗(yàn) 操作易于獲得 繁殖生育力強(qiáng) 數(shù)量較大能夠保障 品系純化，價(jià)格低廉。,,一、 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇,2、 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的年齡與體重,動(dòng) 物　　 大鼠 小鼠 豚鼠

4、 兔　 犬 貓成年年齡（周） 3 2 2 3~4 3~4 3~4 體重（克） 150 15 250 1.5kg 7~15kg 1kg壽命（年） 2~3 2~3 6~8 4~9 15~20 10~12,,,,動(dòng)物數(shù)量：

5、動(dòng)物6組，1-5組為實(shí)驗(yàn)組，6組為蒸餾水對(duì)照組性別：雌雄各半年齡：成年動(dòng)物,生理與健康狀況：未產(chǎn)未孕者、健康動(dòng)物實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的預(yù)檢實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的給藥前禁食處理。,3、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的一般要求,健康動(dòng)物標(biāo)志發(fā)育正常、體態(tài)豐滿、外觀無(wú)畸形；被毛濃密、貼順有光澤、不蓬亂；胸闊寬闊、脊柱不弓不彎；眼睛明亮；表皮無(wú)潰瘍、無(wú)結(jié)痂（注意尾巴）；各天然孔干凈、無(wú)分泌物；行動(dòng)靈活、反應(yīng)敏捷。,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的標(biāo)記,染色法 編號(hào)方法：小鼠頭部為1號(hào)

6、，順時(shí)針編號(hào)，用苦味酸編個(gè)位數(shù)，用伊紅編十位數(shù)。,,染色法,優(yōu)點(diǎn)： 簡(jiǎn)單方便，不痛苦，無(wú)損傷。缺點(diǎn)： 時(shí)間較長(zhǎng)時(shí)，染色劑易褪色； 標(biāo)記容易模糊不清。,劑量選擇及分組,劑量選擇 廣泛查閱文獻(xiàn)資料，估計(jì)毒性中值預(yù)試，求出待測(cè)化學(xué)物0 %~100 %或 10 %~90 %的大致致死劑量范圍設(shè)計(jì)正式試驗(yàn)的劑量和分組,預(yù)實(shí)驗(yàn)：,總的原則是先用少量動(dòng)物，以較大的劑量間距染毒，求出粗略的致死劑量范圍，即確定

7、受試動(dòng)物全部致死的最小劑量（b）和全部不致死的最大劑量（a），即求出待測(cè)化學(xué)物0 %~100 %的大致致死劑量范圍，然后在這個(gè)劑量范圍內(nèi)按幾何級(jí)數(shù)的間距設(shè)計(jì)5~7個(gè)劑量組，組間劑量呈等比級(jí)數(shù)（r），其比值為1.2~1.5。進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)。,通過(guò)預(yù)試，找出受試化學(xué)物引起動(dòng)物死亡的大致劑量范圍，以此為依據(jù)設(shè)計(jì)正式試驗(yàn)的劑量和分組。按下式設(shè)計(jì)劑量組：,式中：r—相鄰兩組劑量的比值，一般為1.2～1.5，b—最低全致死劑量量，a—最高不致死

8、劑量，n—設(shè)計(jì)的組數(shù)。分組恰當(dāng)與否也是確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確的條件之一。因?yàn)榻M數(shù)過(guò)多，需要消耗較多的動(dòng)物，還可能出現(xiàn)較大劑量組動(dòng)物死亡率低于較小劑量組；組數(shù)過(guò)少，不能較精確求出LD50。,根據(jù)公比(r)計(jì)算各組劑量各組劑量分別為 第一組：a 第二組：a r 第三組：a r2 第四組：a r3 第五組：a r4 第六組：a r5,隨機(jī)化分組,將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物編號(hào)，從隨機(jī)數(shù)字表上任意橫行或縱行

9、的任意數(shù)字開始，順序取下數(shù)字，標(biāo)于每個(gè)動(dòng)物號(hào)下，然后用計(jì)劃組數(shù)去除隨機(jī)數(shù)字，所得余數(shù)即為所屬組別。,以20只動(dòng)物的完全隨機(jī)分配為例,完全隨機(jī)分配后各組所屬動(dòng)物號(hào),20只動(dòng)物完全隨機(jī)分配的結(jié)果,受試物的配制方法,（1）受試化學(xué)物的量?。汗腆w受試物用稱量法，液體受試物用稱量法或吸量法。稱量法：取一定量的受試物放入已知重量的容器內(nèi)，稱重，定容，計(jì)算濃度mg/ml，備用。吸量法：依設(shè)計(jì)劑量計(jì)算出應(yīng)吸取液態(tài)受試物的容積，加入容量瓶中，用溶劑

10、加至刻度。,吸量法，計(jì)算公式為：X＝式中： X——應(yīng)吸取受試物的容積； A——設(shè)計(jì)要求的受試物濃度（ mg/ml ）； V——容量瓶容積（ml）； d——受試化學(xué)物比重；,受試物的配制方法,（2）受試化學(xué)物的稀釋等濃度稀釋法：等容量稀釋法：,等濃度稀釋法,將受試物配制成一種濃度，不同劑量組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物單位體重所給受試物的體積不同，劑量越高，所用的體積越大；劑量越低，所用的體積越小。比如某受試物的試驗(yàn)劑

11、量分別為100、200、400和800mg/kg，受試物配制成10 mg/ml，每組動(dòng)物每10g體重分別給與0.1、0.2、0.4和0.8 ml。,等容量稀釋法,將受試物配制成不同濃度，不同劑量組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物單位體重所給受試物的體積相同，劑量越大，受試化學(xué)物配制的濃度越高。上例中，若實(shí)驗(yàn)動(dòng)物按0.2ml/10g b.w容量灌胃,則應(yīng)配制成4個(gè)不同濃度,即5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml和40mg/ml。,染毒途徑的選擇,經(jīng)消化道

12、染毒：經(jīng)口灌胃法 采用專用小鼠灌胃針。 左手抓住動(dòng)物雙耳后至背部的皮膚，將動(dòng)物固定成垂直體位，腹部面向操作。 右手持注射器，將針頭由動(dòng)物口腔側(cè)插入，避牙齒，沿咽后壁緩緩滑人食管。若遇阻力，可輕輕上下滑動(dòng)探索，一旦感覺阻力消失，即深人至胃部。 如遇動(dòng)物掙扎，應(yīng)停止進(jìn)針或?qū)⑨槹纬?，千萬(wàn)不能強(qiáng)行插入，以免穿破食，甚至誤入氣管，導(dǎo)致動(dòng)物 立即死亡。,

13、觀察指標(biāo),中毒癥狀：確定靶器官 ① 行動(dòng)：不安定、多動(dòng)、發(fā)聲； ② 神經(jīng)系統(tǒng)反應(yīng)：舉尾、振顫、痙攣、運(yùn)動(dòng)失調(diào)、姿態(tài)異常； ③ 自主神經(jīng)系統(tǒng)反應(yīng)：眼球突出、流涎、流淚、排尿、下瀉、豎毛、皮膚變色、呼吸。死亡和死亡時(shí)間 病理學(xué)檢查及其他指標(biāo),LD50的計(jì)算（改良寇氏法）,當(dāng)急性毒性試驗(yàn)的最大劑量死亡率為100%，最小劑量的死亡率為0%；各組動(dòng)物數(shù)相等；各劑量組的組距等比或劑量對(duì)數(shù)等差時(shí)，用下述基本公式計(jì)算LD50：,

14、,當(dāng)不含0%和100%死亡率時(shí)，用下式計(jì)算LD50：,,Xm—最大劑量對(duì)數(shù)P—各劑量組死亡率Pm—最高死亡率q—各組劑量存活率，q=1-p,以上各式中：i—組距，即相鄰兩組劑量對(duì)數(shù)劑量之差,Pn—最低死亡率∑p—各劑量組死亡率之和n—各組動(dòng)物數(shù),LD50的局限性,消耗動(dòng)物量大獲得的信息有限動(dòng)物死亡和觀察的癥狀不足以反應(yīng)生理學(xué)、血液學(xué)和其它化驗(yàn)檢查所提供的毒性信息有許多因素影響LD50值的測(cè)定，實(shí)際上測(cè)得的LD50是近似值