雌性大鼠在早期生活中接觸錳導(dǎo)致上調(diào)下丘腦腫瘤相關(guān)基因與錳誘發(fā)兒童性早熟的關(guān)系

1、雌性大鼠在早期生活中接觸錳導(dǎo)致上調(diào)下丘腦腫瘤相關(guān)基因與錳誘發(fā)兒童性早熟的關(guān)系,14營養(yǎng)研 M14831 黃玲艷,,錳的介紹引言研究原因與原理實驗材料與方法實驗結(jié)果與討論結(jié)論,manganese,GnRH：促性腺激素釋放激素Kp：神經(jīng)激肽BE2：雌二醇SAL：生理鹽水AVPV：前腹側(cè)室周POA：視頁前區(qū)MBH：內(nèi)側(cè)基底下丘腦區(qū)RHA：喙下丘腦區(qū),錳的介紹,人體“可能必需微量元素”之一，在人體內(nèi)總量約為

2、10-20mg，主要聚集在肝、胰、腎、骨骼中。生理功能：酶的組成成分或激活劑；維持骨骼正常發(fā)育；促進(jìn)糖和脂肪代謝及抗氧化功能。此外，錳與生殖功能有關(guān)，缺錳可使生殖功能紊亂，精子減少。體內(nèi)對錳的需要量從正常膳食中可得到滿足，一般不會缺乏。錳過量可引起中毒，主要損害中樞神經(jīng)系統(tǒng)和生殖內(nèi)分泌功能紊亂。中國營養(yǎng)學(xué)會推薦承認(rèn)錳的AI值為3.5mg，嬰兒、兒童、青少年、孕婦、入目因資料不足尚未制定錳的AI。糙米、米糠、麥麩、核桃、河蚌、茶葉

3、、查費中錳含量豐，堅果、花生、干豆類也是錳的良好來源；精制谷類、脂肪、魚、禽、肉、奶中含量較低。,錳的介紹,冶金工業(yè)中用來制造特種鋼；鋼鐵生產(chǎn)上用錳鐵合金作為去硫劑和去氧劑。如果在鋼中加入2.5—3.5%的錳，那么所制得的低錳鋼簡直脆得像玻璃一樣，一敲就碎。然而，如果加入13%以上的錳，制成高錳鋼，那么就變得既堅硬又富有韌性。高錳鋼加熱到淡橙色時，變得十分柔軟，很易進(jìn)行各種加工。另外，它沒有磁性，不會被磁鐵所吸引。如今，人們大量用錳

4、鋼制造鋼磨、滾珠軸承、推土機與掘土機的鏟斗等經(jīng)常受磨的構(gòu)件，以及鐵錳錳軌、橋梁等。,,,引言,青春期前接觸稍高于普通水平的錳能誘導(dǎo)雌性大鼠分泌青春期相關(guān)的激素，從而導(dǎo)致早熟。這與作用下丘腦的Mn導(dǎo)致GnRH分泌有關(guān)。因為青春期早熟是一種嚴(yán)重的神經(jīng)內(nèi)分泌紊亂疾病，我們測定早期生活接觸錳是否會早熟上調(diào)一組早先確定與青春期腫瘤生長或抑制有關(guān)的基因表達(dá)、是否會提早青春期早熟時間。雌性大鼠幼崽從出生后的12天開始接受10mg/kg氯化錳或等體

5、積的鹽水灌胃，直至22天或29天。到時，采集血液進(jìn)行雌二醇測定，下丘腦組織干冰冷凍直至評估基因表達(dá)。隨著Mn接觸量的增加，大鼠表現(xiàn)出視前區(qū)和延髓GnRH基因表達(dá)的早熟激素的增加，這表明早熟導(dǎo)致特定腫瘤相關(guān)基因、青春期相關(guān)基因的表達(dá)。,研究原因與原理,通常青春期到來年齡取決于一系列因素：下丘腦GnRH合成的增加和釋放。普遍認(rèn)為，GnRH神經(jīng)元功能在青春期的啟動與代謝信號、基因、環(huán)境影響有關(guān)。因此，任何能促進(jìn)或抑制青春期前GnRH釋放的內(nèi)

6、源或外源的物質(zhì)都能影響GnRH的中央活化，并有可能改變青春期正常發(fā)育過程。研究表明，大鼠和猴子的下丘腦的一些神經(jīng)產(chǎn)物，包括胰島素樣生長因子1、興奮性氨基酸、神經(jīng)激肽B都能激活青春期前下丘腦—垂體軸成熟過程。近年來，我們還發(fā)現(xiàn)，環(huán)境中的Mn能誘導(dǎo)大鼠青春期前GnRH的釋放。此外，當(dāng)青春期前動物暴露于低劑量Mn，使青春期時間提前，且雌性比雄性更加敏感。Mn對下丘腦的作用表明，如果一個人太早接觸低劑量但高水平的這種重金屬，則可能對青春期有

7、害。,研究原因與原理,性早熟是一種嚴(yán)重的內(nèi)分泌紊亂，因此，這引起了有關(guān)青少年（尤其是女性，她們的青春期出現(xiàn)時間更早）對接觸環(huán)境中的Mn的關(guān)注。了解更多的關(guān)于Mn在青春期的作用機制是重要的，特別是年輕人對Mn更敏感（但他們的的口服劑量還不確定）。Mn在青少年的血腦屏障穿透率是成年人的4倍，并且Mn會集聚在下丘腦。一個關(guān)于青春期啟動的概念是，某個特定基因一旦被激活，可能協(xié)調(diào)下丘腦神經(jīng)內(nèi)分泌使其到達(dá)青春期。近年來，與腫瘤生長或抑制有關(guān)的特定

8、基因，也就是我們稱之為腫瘤相關(guān)基因（TAGs）與青春期啟動有關(guān)。最重要的是已確定的KISS-1基因，它編碼Kp家族的蛋白，這些蛋白最早被認(rèn)定為腫瘤抑制基因，但也是青春期前期GnRH分泌的強效刺激劑。在靈長類動物和大鼠都發(fā)現(xiàn)，青春期過程中下丘腦的KISS-1基因表達(dá)增加，這對所有種類生物（尤其是人類）的發(fā)育都至關(guān)重要。雖然KISS-1基因?qū)η啻浩趩邮鞘种匾牡模鼘ι嫌蜗虑鹉X表達(dá)調(diào)節(jié)的研究才開始。,研究原因與原理,即使很多其他的腫瘤

9、相關(guān)基因在性成熟過程中的大部分特定功能還不清楚，但被證實能提高青春期下丘腦的表達(dá)。已有證據(jù)表明，這些基因以錯綜復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)組織，一些被認(rèn)為是上調(diào)水平基因(包括KISS-1），且在它們之間存在互聯(lián)性。因為Mn是環(huán)境中存在的物質(zhì)，且可能刺激下丘腦青春期前期GnRH的釋放，會引起性早熟發(fā)育。因此，確定影響青春期腫瘤相關(guān)基因的影響因素并確定它們之間的表達(dá)（包括KISS-1的表達(dá)）是十分重要的。我們已證實青春期前期接觸Mn可上調(diào)一組與青春期

10、相關(guān)腫瘤基因的表達(dá)。,實驗材料與方法,動物：未成熟雌性大鼠。12h光照、12h黑暗交替，23℃。飲食:Harlin Teklad 2016 ，鐵和錳由微量元素實驗室確定以保持精確。所有程序遵守大學(xué)護(hù)理和實驗室動物護(hù)理使用健康指導(dǎo)。實驗過程：,為了驗證錳在青春期過程中有聯(lián)系、導(dǎo)致早熟的作用，它必須在青春期前期積聚在下丘腦。因為錳缺乏或過量都可改變大腦功能，所以進(jìn)入大腦的錳的量是重要的。,實驗材料與方法,基因選擇：GnRH、KISS-

11、1、GPR54（神經(jīng)激肽B受體）：測定接觸稍高水平錳是否導(dǎo)致表達(dá)Cutl-1、YY1：與KiSS有最強交聯(lián)性USF2（上游刺激因子2）：與生殖功能有關(guān)TSC1（結(jié)節(jié)性硬化癥）、MAF（肌肉腱膜纖維肉瘤）、p53、cyclinD1（細(xì)胞周期蛋白）：細(xì)胞分化、生長、發(fā)育調(diào)節(jié)劑Rheb（大腦同族體）、mTOR（雷帕霉素哺乳動物靶細(xì)胞）：與KiSS的聯(lián)系DMT1（二價金屬轉(zhuǎn)運蛋白）：與錳轉(zhuǎn)輸有關(guān),實驗材料與方法,提取總RNA：大腦勻漿

12、中提取，測260nm的分光光度值。反轉(zhuǎn)錄和實時定量PCR：總RNA（1ug）反轉(zhuǎn)錄為DNA（cDNA），ABI PRISM7500序列檢測系統(tǒng)精確操作。激素分析：雌二醇如前述分析。錳測定：血清、大腦錳由電感耦合質(zhì)譜儀測定。統(tǒng)計分析：T檢驗。INSTA和Prism軟件，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差標(biāo)示，P值小于0.5被認(rèn)為是差異顯著。,實驗材料與方法,數(shù)據(jù)的動物來源：22日齡的34只對照和34只錳接觸動物；29日齡的41只對照

13、和41只錳處理動物。血清雌二醇和錳含量、大腦POA/ RHA區(qū)和MBH區(qū)的E2和錳含量：22日齡的8只對照和8只錳處理大鼠，29日齡13只對照和13只錳處理大鼠。,22日齡、29日齡時雌鼠血清和大腦錳含量,,在兩個時間點，錳處理動物顯示出該元素在大腦AVPV/ POA區(qū)和MBH區(qū)的積累。在22日齡時，血清雌二醇含量是相似的；29日齡時，錳處理組的血清雌二醇水平有顯著增加,接觸低劑量錳的動物較對照組表現(xiàn)為青春期前下丘腦錳的積累。即使實驗

14、組較對照組血清錳水平也偏高，但不明顯，這可被在22日齡、29日齡早上組織收集時間段沒灌胃錳物質(zhì)、持續(xù)排泄24小時解釋。,錳對GnRH基因表達(dá)的影響,,,,在22日齡時，錳沒有影響大腦POA/RHA區(qū)GnRH基因的表達(dá)；但是在29天日齡時，錳引起GnRH基因的表達(dá)，且該動作與血清E2水平提高相關(guān)聯(lián)。,MBH區(qū)不存在GnRH神經(jīng)元，所以該區(qū)沒有測定。,錳對KISS和GPR54基因表達(dá)的影響,,,在29日齡時，錳接觸組較生理鹽水組在POA/R

15、HA區(qū)KISS-1、GPR54表達(dá)增加；在22日齡時，錳接觸組較生理鹽水組只有GPR54表達(dá)增加。,在MBH區(qū)，在任何時間，與生理鹽水組對照，錳沒有影響KISS-1或GPR54表達(dá)。,KiSS基因表達(dá)在POA/RHA區(qū)表達(dá)提高而在其它區(qū)沒影響，可被基因?qū)Υ贫嫉膮^(qū)域相應(yīng)差異來解釋。,多項研究表明，雌二醇差異調(diào)節(jié)嚙齒動物AVPV區(qū)和ARC區(qū)Kp的表達(dá)。Mayer等人認(rèn)為，條件敲除Kp神經(jīng)元的雌激素受體α基因，揭示了這些神經(jīng)元在AVPV區(qū)是

16、由青春期早期雌二醇循環(huán)反饋的，繼而導(dǎo)致GnRH合成，但同時ARC區(qū)的Kp神經(jīng)元是由ERα信號抑制的。我們的研究符合前人研究的關(guān)于接觸錳引起早熟、雌二醇水平提高，導(dǎo)致KiSS基因差異區(qū)域相應(yīng)。差異表達(dá)可在POA/RHA區(qū)而非MBH區(qū)GPR54在22日齡時表達(dá)可見，而POA/RHA區(qū)KiSS-1基因的上調(diào)要在29日齡時才可見。即使GPR基因在22日齡時對錳由響應(yīng)，而此轉(zhuǎn)錄調(diào)控尚不清楚，它不是對雌二醇響應(yīng)的，因為在22日齡時它的表達(dá)依舊很低

17、。錳誘導(dǎo)響應(yīng)使重要的，因為Kp受體是在大腦區(qū)域的GnRH神經(jīng)元上的。如前所述，29日齡時POA/RHA區(qū)KiSS的表達(dá)是在雌二醇的強烈影響下，導(dǎo)致29日齡時錳處理動物教對照組早熟明顯。因此，低劑量接觸錳導(dǎo)致GPR54基因的表達(dá)，導(dǎo)致KiSS基因表達(dá)，導(dǎo)致青春期前期GnRH的分泌。鑒于KiSS-1的激活是青春期必不可少的，我們開始選擇一組轉(zhuǎn)錄因子——腫瘤相關(guān)因子（與KiSS基因控制有關(guān)、被錳影響），識別青春期表達(dá)的增加。,錳對USF2、C

18、utl-1、YY1基因表達(dá)的影響,,錳沒有影響29日齡或22日齡時，POA/RHA區(qū)的USF2、Cutl-1、YY1基因的表達(dá)。,,Rheb是腫瘤相關(guān)因子，作為營養(yǎng)型號輸出至mTOR的中間體，而mTOR是通過Kiss調(diào)控的青春期和生殖調(diào)控的調(diào)控者。因此，我們的結(jié)果證明錳可導(dǎo)致Rheb（mTOR的上游調(diào)節(jié)器）的表達(dá)。證明錳是否作為營養(yǎng)信號或其它生物化學(xué)機制激活Rheb還需更多研究。一旦Rheb被激活，Rheb直接結(jié)合mTOR，這個交互對

19、mTOR的活化是必需的。它是營養(yǎng)響應(yīng)細(xì)胞生長調(diào)控的中介，并參與青春期中心活化。要注意的是29日齡POA/RHA區(qū)（而非MBH區(qū)）Rheb和mTOR表達(dá)的增加是與KiSS表達(dá)增加相聯(lián)系的。MBH去Rheb和mTOR增加也許說明它們是該區(qū)的另一種角色，如營養(yǎng)信號。,錳對Rheb、mTOR基因表達(dá)的影響,,29日齡時，錳提高這兩種基因的表達(dá)。,,和29日齡時其他基因反應(yīng)相同，可能是長期接觸錳導(dǎo)致錳在大腦的積累、青春期前期提高的雌二醇水平綜合作

20、用。一項先前研究表明，mTOR基因的阻塞導(dǎo)致KiSS-1和GnRH基因表達(dá)的降低。這兩項研究表明，此途徑的激活或抑制，會導(dǎo)致KiSS-1和GnRH基因表達(dá)向反方向。此外，他們作為KiSS-1或Kp在調(diào)節(jié)GnRH基因的一個指示劑，GnRH神經(jīng)元表達(dá)Kp受體——GPR54。因此，我們目前結(jié)果清楚地表明此途徑被錳的激活提高青春期前期GnRH神經(jīng)元功能和早熟發(fā)育有關(guān)。,錳對TSC1、Cyeclin D1、p53基因表達(dá)的影響,,錳沒有影響P

21、OA/RHA區(qū)TSC1的表達(dá)。相反地，圖B和C表明：29日齡時，錳提高細(xì)胞周期蛋白D1和p53的表達(dá)。而在22日齡時，錳沒有改變POA/ RHA區(qū)基因的表達(dá)。,,TSC1表現(xiàn)負(fù)調(diào)節(jié)Rheb和mTOR途徑。早熟導(dǎo)致29日齡時POA/RHA區(qū)cyclin D1和p53基因的表達(dá)，在22日齡和29日齡時該腦區(qū)Maf被誘導(dǎo)表達(dá)。在MBH區(qū)只有cyclin D1被錳誘導(dǎo)表達(dá)較正常青春期提高。即使錳激活p53，但它沒有影響YY1（p53的一個重

22、要的負(fù)反饋調(diào)節(jié)器）。因為cyclin D1、p53、Maf都具有關(guān)于細(xì)胞分化、增殖的功能，并與正常青春期啟動的基因表達(dá)提高有關(guān)。因為錳導(dǎo)致早熟也提高了他們各自基因的表達(dá)，這些基因可能在青春期發(fā)育中扮演重要的角色。,錳對Maf基因表達(dá)的影響,,在22日齡和29日齡時POA/RHA區(qū)Maf在都顯出表達(dá)的提高。,在MBH區(qū)，只有29日齡時，D1基因表達(dá)提升；而22日齡時，沒有觀察到這些基因的表達(dá)改變。,錳對DMT1基因表達(dá)的影響,,錳沒有在

23、22日齡時改變POA/RHA區(qū)DMT1基因表達(dá)，但它引起了29天的基因表達(dá)。,在MBH區(qū)，22日齡和29日齡時都沒影響DMT1基因表達(dá)。,,DMT1是一個能轉(zhuǎn)運金屬（包括錳）通過細(xì)胞膜的腫瘤相關(guān)因子蛋白。在大腦，DMT1定位在BBB神經(jīng)元、毛細(xì)管上皮細(xì)胞、腦脊髓液脈絡(luò)膜叢上皮細(xì)胞。錳進(jìn)入大腦，要么通過血管或腦脊髓液。POA/RHA區(qū)和MBH區(qū)是與第三腦室緊密聯(lián)系的。錳迅速聚集在脈絡(luò)膜叢，影響大腦成熟、體內(nèi)平衡、神經(jīng)內(nèi)分泌功能。隨著血錳

24、水平提高，錳進(jìn)入腦脊髓液、脈絡(luò)膜叢也增加。我們首次證明錳在29日齡時在POA/RHA區(qū)導(dǎo)致DMT1基因表達(dá)的。不管錳是否是青春期DMT1的一個重要角色，或像其它腫瘤相關(guān)基因（例如KiSS基因表達(dá)）一樣影響青春期特定過程，有待考證。,結(jié)論,我們的結(jié)果受體證明錳是一種外因的在性成熟中扮演促進(jìn)生理信號表達(dá)的角色，至少，通過下列途徑導(dǎo)致GnRH分泌：因為這種功能和其他可能功能的影響，早期接觸低劑量的錳對性早熟有促進(jìn)作用。這已被很多事實

25、證明：錳在青少年更容易穿過BBB，而沒有能力去消除。青春期前女性在POA/RHA區(qū)、MBH區(qū)累積錳。此外，嬰兒和小孩被認(rèn)為對超量的錳敏感，很大程度上是因為錳的最佳攝入量還沒有被確定。在錳新陳代謝中還觀察到性別差異，如雄鼠清楚錳的能力是雌鼠的2倍。,,結(jié)論,目前證據(jù)表明青春期啟動年齡在變早，性早熟在增加，特別是在女孩中。即使原因還未被確定，青春期啟動時間也許是環(huán)境和基因影響的一種可能性交互聯(lián)系。早熟是因GnRH釋放系統(tǒng)的激活而釋放GnR

26、H造成的依賴性結(jié)果。有趣的是，在男孩下丘腦，下丘腦錯構(gòu)瘤往往是青春期啟動的因子，其它中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變、家族疾病占了一部分，而先天因素只占了10%。在女性中，超過95%早熟沒有特定成因，而且青春期要么正常要么出現(xiàn)太早。及時錳在兩性中都可引起青春期提前出現(xiàn)，但男性的劑量是女性的2.5倍。因此，女性對錳更敏感。因為環(huán)境中的錳可能對青春期啟動有作用，以防萬一早期接觸而導(dǎo)致了早熟，所以確定這個敏感性是重要的。,結(jié)論,我們證明了接觸低劑量錳激活特