植物生理學

1、生物化學課件(供臨床醫(yī)學專業(yè)使用)2008，3,蛋白質的結構與功能,第 一 章,Structure and Function of Protein,一、什么是蛋白質?,蛋白質(protein)是由許多氨基酸(amino acids)通過肽鍵(peptide bond)相連形成的高分子含氮化合物。,概述,二、蛋白質的生物學重要性,1. 蛋白質是生物 體重要組成成分分布廣：所有器官、組織都含有蛋白質；細胞的各個部分都含有蛋白質。含量

2、高：蛋白質是細胞內最豐富的有機分子，占人體干重的45％，某些組織含量更高，例如脾、肺及橫紋肌等高達80％。,1）作為生物催化劑（酶）2）代謝調節(jié)作用3）免疫保護作用4）物質的轉運和存儲5）運動與支持作用6）參與細胞間信息傳遞,2. 蛋白質具有重要的生物學功能,3. 氧化供能,蛋 白 質 的 分 子 組 成The Molecular Component of Protein,第 一 節(jié),一、 組成蛋白質的元素,.主要有C、H、

3、O、N和S。 有些蛋白質含有少量磷或金屬元素鐵、銅、鋅、錳、鈷、鉬，個別蛋白質還含有碘 。,各種蛋白質的含氮量很接近，平均為16％。,由于體內的含氮物質以蛋白質為主，因此，只要測定生物樣品中的含氮量，就可以根據(jù)以下公式推算出蛋白質的大致含量：,100克樣品中蛋白質的含量 ( g % )= 每克樣品含氮克數(shù)× 6.25×100,1/16%,蛋白質元素組成的特點,二、蛋白質的基本單位-氨基酸(一)

4、氨基酸的結構(通式),存在自然界中的氨基酸有300余種，但組成人體蛋白質的氨基酸僅有20種(20-22)，且均屬 L-氨基酸（甘氨酸除外）如圖示。,C H,,,,COOH,,R,R:H 甘AA; R:CH3 丙AAR:CH-OH 蘇AA CH3,,,,,,H2N,非極性側鏈氨基酸非電離極性側鏈氨基酸酸性氨基酸堿性氨基酸,(二）氨基酸的分類,* 20種氨

5、基酸的英文名稱、縮寫符號及分類如下:,甘氨酸 glycine Gly G 5.97,丙氨酸 alanine Ala A 6.00,纈氨酸 valine Val V 5.96,亮氨酸 leucine Leu L 5.98,異亮氨酸 isoleuc

6、ine Ile I 6.02,苯丙氨酸 phenylalanine Phe F 5.48,脯氨酸 proline Pro P 6.30,,非極性側鏈氨基酸,,,,,目 錄,色氨酸 tryptophan Try W 5.89,絲氨酸 serine Ser S

7、 5.68,酪氨酸 tyrosine Try Y 5.66,半胱氨酸 cysteine Cys C 5.07,蛋氨酸 methionine Met M 5.74,天冬酰胺 asparagine Asn N 5.41,谷氨酰胺 glutamine Gln

8、Q 5.65,蘇氨酸 threonine Thr T 5.60,2. 非電離極性側鏈氨基酸,,,,,目 錄,天冬氨酸 aspartic acid Asp D 2.97,谷氨酸 glutamic acid Glu E 3.22,賴氨酸 lysine Lys K 9.7

9、4,精氨酸 arginine Arg R 10.76,組氨酸 histidine His H 7.59,3. 酸性氨基酸,4. 堿性氨基酸,,,,,目 錄,幾種特殊氨基酸,脯氨酸（亞氨基酸）,? 半胱氨酸,胱氨酸,* 以肽鍵相連接,肽鍵(peptide bond)是由一個氨基酸的?-羧基上的羥基與另一個氨基酸的?-氨基上的氫原子脫水縮合而形成的化

10、學鍵,如圖示:,三. 氨基酸在蛋白質中的連接方式,+,,,甘氨酰甘氨酸,肽鍵,H2N,,C,,,C,,OH,,R1,H N H,,,C,,COOH,,,R2,,,,,,C,,N,,,,,,,,O,H,O,,H,* 肽是由氨基酸通過肽鍵縮合而形成的化合物。,* 兩分子氨基酸縮合形成二肽，三分子氨基酸縮合則形成三肽……,* 肽鏈中的氨基酸分子因為脫水縮合而基團不全，被稱為氨基酸殘基(residue)。,* 由十個以內氨基酸相連而成的肽

11、稱為寡肽(oligopeptide)，由更多的氨基酸相連形成的肽稱多肽(polypeptide)。,N 末端：多肽鏈中有自由氨基的一端C 末端：多肽鏈中有自由羧基的一端,多肽鏈有兩端,* 多肽鏈(polypeptide chain)是指許多氨基酸之間以肽鍵連接而成的一種結構。,N末端,C末端,牛核糖核酸酶,. 幾種生物活性肽,1. 谷胱甘肽(glutathione, GSH),GSH過氧化物酶,GSH還原酶,NADPH+H+,NADP

12、+,體內許多激素屬寡肽或多肽,神經(jīng)肽(neuropeptide),2. 多肽類激素及活性肽,抗利尿素與催產(chǎn)素(9肽)、胰高血糖素（29肽）、腦啡肽（5肽）、降鈣素（32肽）、 ACTH（39肽）、胰島素（51肽）肌肽（2肽）、P物質（10肽、屬神經(jīng)肽類）、β內啡肽（31肽）,蛋 白 質 的 分 子 結 構The Molecular Structure of Protein,第 二 節(jié),蛋白質的分子結構包括

13、一級結構(primary structure)二級結構(secondary structure)三級結構(tertiary structure)四級結構(quaternary structure),.概念：蛋白質的一級結構指多肽鏈中氨基酸的排列順序。,一、蛋白質的一級結構,.主要的化學鍵(主鍵)肽鍵，有些蛋白質還包括二硫鍵。,方向: N C; 或 NH2末端 羧基末端,,,

14、.提示：一級結構是蛋白質空間構象和特異生物學功能的基礎。它由遺傳密碼決定,其上有酶切位點,一級結構可測定,并不同種屬間有同源性.,,,,,目 錄,二、蛋白質的空間結構,參與肽鍵的6個原子C?1、、C、O、N、H、C?2位于同一平面，，此同一平面上的6個原子構成了所謂的肽單元 (peptide unit) 。,肽鍵平面—形成二級結構的基礎,,有關對肽鍵平面的描述？,2.二級結構的概念與基本形式A.概念:一條多肽鏈中局部原子的空間排佈B

15、.二級結構的基本形式,（1） ?-螺旋 ( ? -helix ) （2） ?-折疊 ( ?-pleated sheet )（3） ?-轉角 ( ?-turn )（4）不規(guī)則卷曲 ( random coil ),（1）、α螺旋特點 ①、②、③、④（2）、β折疊特點 ①、②、③（3）、 β轉角（4）、無規(guī)則卷曲,?-螺旋,,,,,目 錄,,,,,,,,,,,,,R,R,R,R,R,R,R,R,R,?-折疊,?-折

16、疊,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,N,C,,,,,,,,,,,,,,,,,,,N,C,,,,,,,,,,,,,,,,,,,N,C,,N,C,,,,,維系力:鏈內或鏈間氫鍵,,,N,C,?-轉角,?-轉角,,,轉角,含4個AA,3個肽鍵平面?,β-轉角 ① 180°的轉角部位②由4個氨基酸殘基構成③由第一個殘基的羰基氧（O）與第四個殘基的氨基氫（H）可形成氫鍵④多含脯氨酸和甘氨酸,不規(guī)則卷曲,環(huán)或卷曲結構 ：

17、無規(guī)卷曲是用來闡述沒有確定規(guī)律性的那部分肽鏈結構。 相對沒有規(guī)律性的排布，但是其同樣表現(xiàn)重要生物學功用。 C.二級結構的維系力:氫鍵,,.模體,在許多蛋白質分子中，可發(fā)現(xiàn)二個或三個具有二級結構的肽段，在空間上相互接近，形成一個特殊的空間構象，被稱為模體(motif)。,,鈣結合蛋白中結合鈣離子的模體,鋅指結構,,N,C,,N,C,.氨基酸殘基的側鏈對二級結構形成的影響,蛋白質二級結構是以一級結構為基礎的。一段肽鏈其氨基酸殘基的側鏈適

18、合形成?-螺旋或β-折疊，它就會出現(xiàn)相應的二級結構。,(二)、蛋白質的三級結構,一條多肽鏈中全部氨基酸殘基(全部元素)的相對空間位置。即肽鏈中所有原子在三維空間的排布位置。包括主鏈，側鏈的全部內容,1. 概念,為非共價鍵，次級鍵,（鹽鍵）,,,,,,目 錄,肌紅蛋白 (Mb),,肌紅蛋白為單肽鏈蛋白質，含153個氨基酸殘基，它含有8個α螺旋區(qū)，依次稱為A到H螺旋，并含有β轉角及環(huán)-卷曲等二級結構。,2.維系力 亞基之間的結合力有疏水作用

19、， Van der Waals力以及氫鍵和離子鍵,還有二硫鍵。,（三）蛋白質的四級結構,(或蛋白質分子中各亞基的空間排布及亞基接觸部位的布局和相互作用，稱為蛋白質的四級結構。),1.概念 有些蛋白質分子含有二條或多條多肽鏈，每一條多肽鏈都有完整的三級結構，稱為蛋白質的四級結構.而每條多肽鏈被稱為亞基 (subunit)。,.蛋白質的四級結構,具有四級結構蛋白質,review,,Summary,三、 蛋白質結構與功能的關系,(一)、蛋白

20、質的一級結構與功能的關系 (二)、蛋白質的空間結構與功能的關系,.一級結構是空間構象的基礎,(一)、蛋白質一級結構與功能的關系,.一級結構與功能的關系,例：鐮刀形紅細胞貧血,這種由蛋白質分子發(fā)生變異所導致的疾病，稱為“分子病”。,（谷AA）,（頡AA）,,,,,,,,,S S,,,,S S,,,,S S,,N,N,A鏈、21AA,B鏈、30AA,胰島 素 A5 A6

21、 A10 B30人 Thr Ser Ile Thr 豬 Thr Ser Ile Ala,.肌紅蛋白與血紅蛋白的結構,(二)、蛋白質空間結構與功能的關系,,,,,目 錄,Hb與Mb一樣能可逆地與O2結

22、合， Hb與O2結合后稱為氧合Hb。氧合Hb占總Hb的百分數(shù)（稱百分飽和度）隨O2濃度變化而改變。,.血紅蛋白的構象變化與結合氧,肌紅蛋白(Mb)和血紅蛋白(Hb)的氧解離曲線,* 協(xié)同效應(cooperativity),一個寡聚體蛋白質的一個亞基與其配體結合后，能影響此寡聚體中另一個亞基與配體結合能力的現(xiàn)象，稱為協(xié)同效應。 如果是促進作用則稱為正協(xié)同效應 (positive cooperativity)如果是抑制作用則稱為

23、負協(xié)同效應 (negative cooperativity),,,血紅素與氧結合后，鐵原子半徑變小，就能進入卟啉環(huán)的小孔中，繼而引起肽鏈位置的變動。,變構效應(allosteric effect),蛋白質空間結構的改變伴隨其功能的變化，稱為變構效應。,天然狀態(tài)，有催化活性,尿素、 β-巰基乙醇,,去除尿素、β-巰基乙醇,非折疊狀態(tài)，無活性,,.蛋白質構象改變與疾病,

24、蛋白質構象疾?。喝舻鞍踪|的折疊發(fā)生錯誤，盡管其一級結構不變，但蛋白質的構象發(fā)生改變，仍可影響其功能，嚴重時可導致疾病發(fā)生。,蛋白質構象改變導致疾病的機理：有些蛋白質錯誤折疊后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉樣纖維沉淀，產(chǎn)生毒性而致病，表現(xiàn)為蛋白質淀粉樣纖維沉淀的病理改變。,這類疾病包括：人紋狀體脊髓變性病、老年癡呆癥、亨停頓舞蹈病、瘋牛病等。,瘋牛病中的蛋白質構象改變瘋牛病是由朊病毒蛋白(prion protein, PrP)引起的

25、一組人和動物神經(jīng)退行性病變。正常的PrP富含α-螺旋，稱為PrPc。PrPc在某種未知蛋白質的作用下可轉變成全為β-折疊的PrPsc，從而致病。,第三節(jié),蛋白質的理化性質The Physical and Chemical Characters of Protein,蛋白質分子除兩端的氨基和羧基可解離外，氨基酸殘基側鏈中某些基團，在一定的溶液pH條件下都可解離成帶負電荷或正電荷的基團。,* 蛋白質的等電點( isoelectric

26、point, pI) 當?shù)鞍踪|溶液處于某一pH時，蛋白質解離成正、負離子的趨勢相等，即成為兼性離子，凈電荷為零，此時溶液的pH稱為蛋白質的等電點。,一、蛋白質兩性解離和等電點,Pr,,,COOH,NH3+,,,OH-,H+,Pr,,,NH3+,COO_,,,OH-,Pr,H+,,NH2,,COO,-,正離子pH＜ pI,兩性離子pH﹦pI,負離子pH ＞ pI,蛋白質等電點,Protein

27、 pIPepsin <1.0Serum albumin 4.9Urease 5.0Hemoglobin 6.8Myoglobin 7.0Chymotrypsinogen

28、 9.5Lysozyme 11.0,二.蛋白質的膠體性質,蛋白質屬于生物大分子之一，分子量可自1萬至100萬之巨，其分子的直徑可達1～100nm，為膠粒范圍之內。,* 蛋白質膠體穩(wěn)定的因素顆粒表面電荷水化膜,水化膜,溶液中蛋白質的聚合沉淀,三.蛋白質的變性、沉淀和凝固,* 蛋白質的變性(denaturation)在某些物理和化學因素作用下，其特定的空間構

29、象被破壞，也即有序的空間結構變成無序的空間結構，從而導致其理化性質改變和生物活性的喪失。,引起變性的因素:物理、化學與生物學因素如如加熱、乙醇等有機溶劑、強酸、強堿、重金屬離子及生物堿試劑等 。,變性蛋白質的特點:,粘度增加，溶解度降低，易沉淀,易被蛋白酶降解,喪失生物學活性.,應用舉例臨床醫(yī)學上，變性因素常被應用來消毒及滅菌。此外, 防止蛋白質變性也是有效保存蛋白質制劑（如疫苗等）的必要條件。,若蛋白質變性程度較輕，去除變性因素

30、后，蛋白質仍可恢復或部分恢復其原有的構象和功能，稱為復性(renaturation) 。,天然狀態(tài)，有催化活性,尿素、 β-巰基乙醇,,去除尿素、β-巰基乙醇,非折疊狀態(tài)，無活性,,* 蛋白質沉淀在一定條件下，蛋白疏水側鏈暴露在外，肽鏈融會相互纏繞繼而聚集，因而從溶液中析出。變性的蛋白質易于沉淀，有時蛋白質發(fā)生沉淀，但并不變性。,* 蛋白質的凝固作用(protein coagulation) 蛋白質變性后的絮狀物加熱可變成比較

31、堅固的凝塊，此凝塊不易再溶于強酸和強堿中。,四、蛋白質的紫外吸收,由于蛋白質分子中含有共軛雙鍵的酪氨酸和色氨酸，因此在280nm波長處有特征性吸收峰。蛋白質的OD280與其濃度呈正比關系，因此可作蛋白質定量測定。（與Trp Tyr有關）,五、 蛋白質的呈色反應,⒈茚三酮反應(ninhydrin reaction) 蛋白質經(jīng)水解后產(chǎn)生的氨基酸也可發(fā)生茚三酮反應。,⒉雙縮脲反應(biuret reaction)蛋白質和多肽分子中肽鍵

32、在稀堿溶液中與硫酸銅共熱，呈現(xiàn)紫色或紅色，此反應稱為雙縮脲反應，雙縮脲反應可用來檢測蛋白質水解程度。,A、蛋白質的分離和純化,（一）透析及超濾法,* 透析(dialysis)利用透析袋把大分子蛋白質與小分子化合物分開的方法。,* 超濾法 應用正壓或離心力使蛋白質溶液透過有一定截留分子量的超濾膜，達到濃縮蛋白質溶液的目的。,生物化學技術：,&.透析,（二）丙酮沉淀、鹽析及免疫沉淀,*使用丙酮沉淀時，必須在0～4℃低溫下進行，丙

33、酮用量一般10倍于蛋白質溶液體積。蛋白質被丙酮沉淀后，應立即分離。除了丙酮以外，也可用乙醇沉淀。,*鹽析(salt precipitation)是將硫酸銨、硫酸鈉或氯化鈉等加入蛋白質溶液，使蛋白質表面電荷被中和以及水化膜被破壞，導致蛋白質沉淀。,* 免疫沉淀法：將某一純化蛋白質免疫動物可獲得抗該蛋白的特異抗體。利用特異抗體識別相應的抗原蛋白，并形成抗原抗體復合物的性質，可從蛋白質混合溶液中分離獲得抗原蛋白。,,,,,,,,,,,,,bi

34、nding,,,,,,,wash,elution,免疫沉淀,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,抗體,Protein A-agarose,（三）電泳,蛋白質在高于或低于其pI的溶液中為帶電的顆粒，在電場中能向正極或負極移動。這種通過蛋白質在電場中泳動而達到分離各種蛋白質的技術, 稱為電泳(elctrophoresis) 。根據(jù)支撐物的不同，可分為薄膜電泳、凝膠電泳等。,

35、幾種重要的蛋白質電泳*SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，常用于蛋白質分子量的測定。*等電聚焦電泳，通過蛋白質等電點的差異而分離蛋白質的電泳方法。*雙向凝膠電泳是蛋白質組學研究的重要技術。,SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳,（四）層析,層析(chromatography)分離蛋白質的原理待分離蛋白質溶液（流動相）經(jīng)過一個固態(tài)物質（固定相）時，根據(jù)溶液中待分離的蛋白質顆粒大小、電荷多少及親和力等，使待分離的蛋白質組分在兩相中反復分配，并以不

36、同速度流經(jīng)固定相而達到分離蛋白質的目的 。,蛋白質分離常用的層析方法* 離子交換層析：利用各蛋白質的電荷量及性質不同進行分離。* 凝膠過濾(gel filtration)又稱分子篩層析，利用各蛋白質分子大小不同分離。,,,,,目 錄,,,,,目 錄,（五）超速離心,* 超速離心法(ultracentrifugation)既可以用來分離純化蛋白質也可以用作測定蛋白質的分子量。,*蛋白質在離心場中的行為用沉降系數(shù)(sedimenta

37、tion coefficient, S)表示,沉降系數(shù)與蛋白質的密度和形狀相關 。,因為沉降系數(shù)S大體上和分子量成正比關系，故可應用超速離心法測定蛋白質分子量，但對分子形狀的高度不對稱的大多數(shù)纖維狀蛋白質不適用。,B、多肽鏈中氨基酸序列分析,分析已純化蛋白質的氨基酸殘基組成,測定多肽鏈的氨基末端與羧基末端為何種氨基酸殘基,把肽鏈水解成片段，分別進行分析,測定各肽段的氨基酸排列順序，一般采用Edman降解法,一般需用數(shù)種水解法，并分析出各

38、肽段中的氨基酸順序，然后經(jīng)過組合排列對比，最終得出完整肽鏈中氨基酸順序的結果。,,,,,通過核酸來推演蛋白質中的氨基酸序列,按照三聯(lián)密碼的原則推演出氨基酸的序列,分離編碼蛋白質的基因,測定DNA序列,排列出mRNA序列,,,,C、蛋白質空間結構測定,* 二級結構測定通常采用圓二色光譜(circular dichroism，CD)測定溶液狀態(tài)下的蛋白質二級結構含量。 ?-螺旋的CD峰有222nm處的負峰、208nm處的負峰和198 n

39、m處的正峰三個成分；而?-折疊的CD譜不很固定。,* 三級結構測定X射線衍射法(X-ray diffraction)和核磁共振技術(nuclear magnetic resonance, NMR)是研究蛋白質三維空間結構最準確的方法。,* 用分子力學、分子動力學的方法，根據(jù)物理化學的基本原理，從理論上計算蛋白質分子的空間結構。,根據(jù)蛋白質的氨基酸序列預測其三維空間結構,* 通過對已知空間結構的蛋白質進行分析，找出一級結構與空間結構的