rt-lamp技術檢測煙草環(huán)斑病毒的研究【開題報告】

1、<p><b>　　畢業(yè)論文開題報告</b></p><p><b>　　食品質量與安全</b></p><p>　　RT-LAMP技術檢測煙草環(huán)斑病毒的研究</p><p><b>　　選題的背景與意義</b></p><p>　　煙草環(huán)斑病毒（Tobacco ri

2、ngspot virus，TRSV）是中國進境檢疫法規(guī)中明確規(guī)定禁止入境的危害性有害生物。該病毒寄主范圍廣，可侵染52科246種植物，是果樹、蔬菜、花卉等經濟作物的重要病害之一，發(fā)生嚴重時可導致絕產。中國進口的植物種球莖和苗木中攜帶該病毒的風險很大。</p><p>　　國內外針對TRSV所用的檢測技術主要有DAS-ELISA和RT-PCR技術。相比傳統(tǒng)的電鏡觀察和生物學鑒定，這2種方法在檢測周期方面具有明顯的優(yōu)

3、勢，操作快速簡便和高通量。但是，DAS-ELISA的檢測周期仍然需要6 h左右，且檢測靈敏度相對較低，假陽性較高；RT-PCR的整個檢測周期仍需4 h左右，且需要特殊的PCR擴增設備、電泳設備和紫外成像設備，儀器昂貴，對人員技術能力要求較高，不利于技術向基層實驗室的推廣及現(xiàn)場檢疫。</p><p>　　環(huán)介導等溫擴增技術（Lamp-mediated isothermal amplification,LAMP）作為

4、一種新的核酸擴增方法，依賴于能夠識別靶序列上6個特異區(qū)域的引物和一種具解旋功能且呈瀑布式擴增的Bst DNA酶，在等溫條件下可高效、快速和特異地擴增靶序列。該方法擴增效率非常高，靈敏度高，特異性強，只要恒溫水浴鍋即可，擴增結果加入熒光染料后可用肉眼直接觀察，無需特殊儀器，操作方便，對設備要求低，LAMP的整個反應周期只需1.5~2.5 h，檢測周期非常短。</p><p>　　本研究的建立，將提供一種快速簡便檢測

5、煙草環(huán)斑病毒的方法，使該病毒乃至動植物種的其他病毒、細菌及真菌的基層實驗室檢測和現(xiàn)場檢疫成為可能。</p><p>　　二、研究的基本內容與擬解決的主要問題：</p><p>　　本研究旨在建立用RT-LAMP技術檢測植物中的煙草環(huán)斑病毒的方法。整個研究內容包括：(1)、設計RT-LAMP技術檢測煙草環(huán)斑病毒的引物序列；(2)、確定RT-LAMP技術檢測煙草環(huán)斑病毒的最佳溫度；(3)、確定

6、RT-LAMP技術檢測煙草環(huán)斑病毒的最佳反應時間；(4)、檢驗本研究設計的引物在植物病毒檢驗中的特異性；(5)、比較常規(guī)的RT-PCR方法和本研究建立的方法檢測煙草環(huán)斑病毒的靈敏度；(6)、檢驗用熒光染料SYBR green I判斷實驗結果的準確性；(7)、檢驗本研究建立的方法在樣品檢驗中的應用。</p><p>　　三、研究的方法與技術路線：</p><p>　　針對本研究的內容設計研究

7、方法和技術路線如下：</p><p>　　(1)、查閱文獻，建立初步的煙草環(huán)斑病毒的RT-LAMP檢測方法；</p><p>　　(2)、根據(jù)GenBank（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）中已登錄的煙草環(huán)斑病毒的外殼蛋白基因序列(D12477)，設計F3、B3、FIP（F1c＋TTTT+F2）、BIP（B1c＋TTTT＋B2）、Loop1和Loop2共6條引物；&

8、lt;/p><p>　　(3)、按照建立的煙草環(huán)斑病毒的RT-LAMP檢測方法，設置58℃、60℃、63℃、65℃四個反應溫度進行溫度優(yōu)化試驗；</p><p>　　(4)、按照建立的煙草環(huán)斑病毒的RT-LAMP檢測方法，在最佳溫度條件下，設置30 min、60 min、90 min三個反應時間進行時間優(yōu)化試驗；</p><p>　　(5)、用煙草環(huán)斑病毒、南芥菜花葉病

9、毒、香石竹環(huán)斑病毒、黃瓜綠斑駁病毒、番茄環(huán)斑病毒以及馬鈴薯V病毒等幾種常見的植物病毒RNA進行特異性試驗；</p><p>　　(6)、用10－1、10－2、10－3、10－4和10－5稀釋的煙草環(huán)斑病毒RNA樣品為模板，用常規(guī)的RT-PCR方法和本研究建立的RT-LAMP方法進行擴增靈敏度比對試驗；</p><p>　　(7)、用凝膠電泳和熒光染料SYBR green I兩種方法判斷靈敏

10、度試驗中的RT-LAMP擴增產物，比較熒光染料SYBR green I判斷實驗結果的準確性；</p><p>　　(8)、用已用DAS-ELISA檢測呈TRSV陽性的進境大豆樣品，采用本研究建立的RT-LAMP方法進行擴增檢測，結果采用SYBR green I染色觀察，檢驗該方法在樣品檢驗中的應用。</p><p>　　四、研究的總體安排與進度：</p><p>　

11、　(1)、煙草環(huán)斑病毒的RT-LAMP檢測方法的初步建立。2010年12月15日至2010年12月25日。</p><p>　　(2)、RT-LAMP技術檢測煙草環(huán)斑病毒的引物序列的設計。2010年12月26日至2010年12月31日。</p><p>　　(3)、RT-LAMP技術檢測煙草環(huán)斑病毒的溫度優(yōu)化試驗。2011年1月3日至201年1月9日。</p><p&g

12、t;　　(4)、RT-LAMP技術檢測煙草環(huán)斑病毒的時間優(yōu)化試驗。2011年1月10日至2011年1月16日。</p><p>　　(5)、本研究設計的引物在植物病毒檢驗中的特異性檢驗試驗。2011年1月17日至2011年1月23日。</p><p>　　(6)、常規(guī)的RT-PCR方法和本研究建立的方法檢測煙草環(huán)斑病毒的靈敏度比較試驗；用熒光染料SYBR green I判斷結果的準確性試驗

13、。2011年2月21日至2011年3月6日。</p><p>　　(7)、本研究建立的方法在進境大豆樣品檢驗中的應用試驗。2011年3月7日至2011年3月11日。</p><p><b>　　主要參考文獻：</b></p><p>　　[1] 洪健，周雪平．ICTV第八次報告的最新植物病毒分類系統(tǒng)[J]．植物病理學報，2005，35（6）：1

14、-9．</p><p>　　[2] Moriones, E ， Navas-Castillo, J．Tomato yellow leaf curl virus, an emerging virus complex causing epidemics worldwide [J]．Virus Research， 2001， 71： 123-134．</p><p>　　[3] Briddon,

15、 R W.，Mansoor, S.，Bedford, I.D.，et al．Clones of cotton leaf curl geminivirus induce symptoms atypical of cotton leaf curl disease [J]．Virus Genes，2000，20：19-26．</p><p>　　[4] Gracia, C.M.，De, B.，Granval, D.M.

16、 ，G, V．Cuesta Occurrence of Different Tospoviruses in Vegetable Crops in Argentina [J]．Journal of Phytopathology，1998，147(4)：223-227．</p><p>　　[5] J. D. CASTELLO，Assistant Professor，et al．Detection of Tobacc

17、o Mosaic and Tobacco Ringspot Viruses in White Ash Trees by Enzyme-Linked Immunosorbent Assay [J]．The American Phytopathological Society，1984，68(9)：787-790．</p><p>　　[6] 蘭玉菲，郗麗君，等．植物病毒檢測技術[J]．山東農業(yè)科學，2006，5：5

18、8~62．</p><p>　　[7] 王健華，王運勤，等．植物病毒檢測技術研究進展[J]．熱帶農業(yè)科學，2005，3（25）：71~75．</p><p>　　[8] 唐畢鋒，馬立業(yè)，等．環(huán)介導等溫擴增技術的應用和發(fā)展[J]．實用醫(yī)學雜志，2008，22（24）：3972～3974．</p><p>　　[9] 何琳，徐海圣，等．白斑綜合征病毒環(huán)介導等溫擴增快速檢

19、測方法的建立[J]．水產學報，2010，34（4）：598-603．</p><p>　　[10] 孫穎杰，岳志芹，等．牙鲆彈狀病毒環(huán)介導等溫擴增檢測方法的建立與應用[J]．華中農業(yè)大學學報，2010，29（2）：203-207．</p><p>　　[11] 謝青梅，曹永曹，等．H5亞型禽流感病毒的逆轉錄環(huán)介導等溫擴增（RT-LAMP）檢測技術[J]．中國獸醫(yī)學報，2010，30（1）：

20、41-46．</p><p>　　[12] Manmohan P， Guillermo P，ShingoInoue，et al．Real-time reverse transcription loop-mediated isothermal amplification for rapid detection of West Nile virus [J]．J Clin Microbiol，2004，42(1)：25

21、7-263．</p><p>　　[13] Poon L，Leung C S，Chan K H，et al．Detection of humman influenza A viruses by loop-mediated isothernal amplication [J]．ClinMcrobiol，2004，425：1956-1961．</p><p>　　[14] 黃帆，李琳，等．DN

22、A環(huán)介導恒溫擴增技術速檢測結核分枝桿菌的研究[J]．現(xiàn)代食品科技，2008，24（8）：835-838．</p><p>　　[15] 包云娟，朱水榮．環(huán)介導等溫技術在假結核耶爾森菌檢測中的應用[J]．微生物檢測方法，2010，3(20)：559-560．</p><p>　　[16] 王敏雅，徐明漢，等．沙門菌invA基因LAMP快速檢測法的建立和初步應用[J]．中國衛(wèi)生檢驗雜志，200

23、8，18(10)：1971-1981．</p><p>　　[17] 王中光，張守發(fā)，等．牛瑟氏泰勒蟲環(huán)介導等溫擴增檢測方法的建立[J]．中國預防獸醫(yī)學報，2010，32(2)：108-111．</p><p>　　[18] 夏永恒，楊兵，等．2種雞免疫抑制性疾病LAMP檢測方法的建立[J]．中國動植物檢疫，2009，26（5）：29-32．</p><p>　　[

24、19] 劉寶山，潘樹德，等．環(huán)介導等溫擴增技術在畜禽疾病診斷中的應用[J]．中國獸醫(yī)雜志，2009，45(9)：64-65．</p><p>　　[20] 趙飛，鄒為民．LAMP法在水產動物病原快速檢測中的應用[J]．南方水產，2007，3（2）：71-75．</p><p>　　[21] 甘文佳，胡旭初．LAMP技術及其在病原診斷中的應用[J]．中國病原生物學雜志，2010，5(2)：1

25、43-145．</p><p>　　[22] 魯勇，李紅海，等．LAMP快速檢測沙門菌invA基因的方法建立于應用[J]．浙江中西醫(yī)結合雜志，2009，19（4）：216-218．</p><p>　　[23] S. Fukuta，T. Iida，Y. Mizukami，et al．Detection of Japanese yam mosic virus by RT-LAMP [J]．A

26、rchives of Virology，2003，148：1713-1720.</p><p>　　[24] 周廣青，?；菔|，邵軍軍．環(huán)介導等溫基因擴增技術及其在病毒檢測中的應用[J]．生物技術通訊，2008，2：290～292．</p><p>　　[25] 劉佳，黃叢林，等．環(huán)介導等溫擴增技術檢測菊花中番茄不孕病毒[J]．中國農業(yè)科學, 2010，43（6）：1288-1294．<

27、;/p><p>　　[26] Kaneko H，Iida Aoki K，et al．Swnsitive and rapid detection of herpes simplex virus and varicella-zoster virus DNA by loop-mediated isothermal amplification [J]．J Clin Microbiol，2005，43(3)：3290-3296