海蜇酶溶性膠原蛋白的提取工藝研究【畢業(yè)設(shè)計(jì)】

1、<p><b>　　本科畢業(yè)設(shè)計(jì)</b></p><p><b>　?。?0_ _屆）</b></p><p>　　海蜇酶溶性膠原蛋白的提取工藝研究</p><p>　　所在學(xué)院 </p><p>　　專(zhuān)業(yè)班級(jí) 食品質(zhì)量與

2、安全 </p><p>　　學(xué)生姓名 學(xué)號(hào) </p><p>　　指導(dǎo)教師 職稱(chēng) </p><p>　　完成日期 年 月 </p><p><b>　　目 錄</b><

3、;/p><p><b>　　1 引言1</b></p><p>　　1.1 膠原蛋白概述1</p><p>　　1.1.1 膠原蛋白的結(jié)構(gòu)1</p><p>　　1.1.2 膠原蛋白的提取方法的研究進(jìn)展1</p><p>　　1.1.3 膠原蛋白的應(yīng)用2</p>&l

4、t;p>　　1.2 海蜇膠原蛋白的概述2</p><p>　　1.2.1 海蜇的生物學(xué)特性2</p><p>　　1.2.2 海蜇膠原蛋白的研究進(jìn)展3</p><p>　　1.3 研究的目的和意義3</p><p>　　2 材料與方法3</p><p>　　2.1 材料與試劑3</p

5、><p>　　2.2 儀器與設(shè)備4</p><p><b>　　2.3 方法4</b></p><p>　　2.3.1 工藝流程4</p><p>　　2.3.2 樣品的前處理4</p><p>　　2.3.3 酶溶性膠原蛋白的提取4</p><p>　　2

6、.3.4 膠原蛋白提取率的測(cè)定4</p><p>　　2.3.5 單因素的確定5</p><p>　　2.3.6 提取工藝參數(shù)優(yōu)化5</p><p>　　2.3.7 膠原蛋白的理化分析5</p><p>　　3 結(jié)果與分析6</p><p>　　3.1 羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制6</p>

7、;<p>　　3.2 提取時(shí)間對(duì)酶溶性膠原蛋白提取率的影響6</p><p>　　3.3 液料比對(duì)膠原蛋白提取率的影響6</p><p>　　3.4 胃蛋白酶濃度對(duì)膠原蛋白提取率的影響7</p><p>　　3.5 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果7</p><p>　　3.6 氨基酸組成10</p>

8、<p>　　3.7 紫外光譜分析11</p><p>　　3.8 紅外光譜分析12</p><p><b>　　4 小結(jié)13</b></p><p>　　致 謝錯(cuò)誤!未定義書(shū)簽。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)14</b></p><p>　　

9、摘要：我國(guó)海蜇資源豐富，分布廣泛，并具有很高的營(yíng)養(yǎng)及經(jīng)濟(jì)價(jià)值，本文以東海海域新鮮海蜇為原料，通過(guò)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)對(duì)海蜇膠原蛋白酶法提取進(jìn)行優(yōu)化，并研究了PSC的部分理化性質(zhì)。以膠原蛋白得率為指標(biāo)，酶法提取的最佳工藝為：4 ℃條件下提取時(shí)間為41h，液料比19:1，酶濃度為4%，在此條件下海蜇膠原蛋白的預(yù)測(cè)提取率為0.411%，與預(yù)測(cè)值的誤差為4.42%，由此可見(jiàn)，響應(yīng)面法優(yōu)化的最佳提取工藝可靠。在膠原蛋白特性研究結(jié)果中顯示：該膠原蛋白氨基酸含

10、量豐富，其中Gly含量最高，約占總氨基酸的22%；紫外光譜掃描顯示酶促溶性膠原蛋白（PSC）的最大吸收峰在208 nm；紅外光譜掃描顯示膠原蛋白基本保留了三股螺旋結(jié)構(gòu)。</p><p>　　關(guān)鍵詞：海蜇；酶溶性膠原蛋白；提取工藝</p><p>　　Abstract: Jellyfish is one of the most important fishery resources in C

11、hina, which has high nutritional and economic value. In this paper, the extracting conditions of pepsin-soluble collagen (PSC) from jellyfish were optimized based on response surface method. The result shows that the opt

12、imal condition of PSC extraction was obtained as following: extraction time 41h, the solid/water ratio of 19:1, enzyme concentration of 4% at 4℃, under these condition the prediction extraction rate of jellyfi</p>

13、<p>　　Keywords: Jellyfish; Pepsin-soluble collagen; Extraction</p><p><b>　　1 引言</b></p><p>　　1.1 膠原蛋白概述</p><p>　　膠原蛋白是動(dòng)物體內(nèi)含量最豐富，分布最廣泛的蛋白質(zhì)，占人體內(nèi)總蛋白質(zhì)的25%~30%[1]，存在于

14、動(dòng)物的骨、皮、腱、韌帶和軟骨中，是結(jié)締組織中極其重要的一種結(jié)構(gòu)蛋白[2]。膠原蛋白的作用是支撐器官和保護(hù)肌體，同時(shí)也是組成細(xì)胞間質(zhì)的最重要的功能蛋白質(zhì)。</p><p>　　1.1.1 膠原蛋白的結(jié)構(gòu)</p><p>　　膠原蛋白種類(lèi)繁多，結(jié)構(gòu)復(fù)雜。但是膠原蛋白的基本組成卻是大同小異：三條左手螺旋的α肽鏈在氨基酸殘基的作用下以右手螺旋方式形成的蛋白質(zhì)[3]。在膠原蛋白的肽鏈甘氨酸占總氨基

15、酸的1/3，與另外兩個(gè)氨基酸形成三肽Gly-X-Y（X，Y經(jīng)常是脯氨酸或者羥脯氨酸）的重復(fù)區(qū)域，各肽鏈以肽鏈之間Gly殘基形成的氫鍵連接到一起。其中Gly殘基位于螺旋的中心軸線上，其他氨基酸則占據(jù)三股螺旋的外圍位置。另外，膠原蛋白也可通過(guò)羥脯氨酸殘基分子內(nèi)氫鍵來(lái)穩(wěn)定自身。另外膠原蛋白還具有非三螺旋結(jié)構(gòu)域。絕大部分蛋白質(zhì)幾乎不含羥脯氨酸，所以將羥脯氨酸可以作為膠原蛋白的特征氨基酸[4]。</p><p>　　1.1

16、.2 膠原蛋白的提取方法的研究進(jìn)展</p><p>　　膠原蛋白的提取方法主要有：酸法浸提、熱水浸提、堿法浸提與酶法浸提，其基本的原理都是根據(jù)膠原蛋白本身的特性，改變蛋白質(zhì)所處的外界環(huán)境，將膠原蛋白從其他蛋白質(zhì)中分離出來(lái)。因?yàn)楦鞣N方法本身缺點(diǎn)的限制[5]，實(shí)際提取過(guò)程中經(jīng)常將不同方法相互結(jié)合。另外高壓技術(shù)在膠原蛋白提取中的應(yīng)用也引起了越來(lái)越多研究者的興趣。</p><p>　　1.1.2

17、.1 酶法浸提</p><p>　　酶法提取時(shí)得到的是酶溶性膠原蛋白( Pepsin soluble collagen, 簡(jiǎn)稱(chēng)PSC)，是采用對(duì)膠原作用較弱的酶處理樣品，這種酶只作用于膠原蛋白的非螺旋端肽，而不會(huì)改變膠原蛋白的三螺旋結(jié)構(gòu)。目前應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)中的酶主要有胃蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶等[6-8]。酶解膠原蛋白的工藝可以分為單酶水解法和多酶水解法[9]。影響酶法浸提的因素有溫

18、度、時(shí)間、酶量、pH、料液比等。</p><p>　　胡建平[10]采用胃蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶三種不同蛋白酶提取鰱魚(yú)磷膠原蛋白，選取效果最好的酶用正交試驗(yàn)優(yōu)化膠原蛋白制備工藝。結(jié)果表明，胃蛋白酶提取鰱魚(yú)磷膠原蛋白效果最好，其最佳提取工藝條件為：40℃、48h、酶量4%和pH2，提取率為56.8%。陳小娥等[11]以安康魚(yú)皮為原料，采用酶法提取膠原蛋白，用正交實(shí)驗(yàn)堆安康魚(yú)皮膠原蛋白提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明

19、，當(dāng)胃蛋白酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)l%，料液比1:10，酶解時(shí)間6h，酶解溫度5℃，平均提取率為11.01%，純度為96.5%。</p><p>　　1.1.2.2 酸法浸提</p><p>　　酸法浸提，所用酸大多數(shù)是醋酸，有的還用檸檬酸、磷酸等[12]，其中檸檬酸因不產(chǎn)生顏色和異味得以在視屏工業(yè)的膠原蛋白提取中廣泛的應(yīng)用。酸法提取膠原蛋白的工藝流程為：水產(chǎn)品→預(yù)處理→酸萃取→離心（上清液）→鹽析（

20、NaCl）→ 透析→ASC濃縮液→冷凍干燥，即可得到酸溶性膠原蛋白（Acid-soluble collagen ，ASC)[13]。張虹、桌素珍等[14]采用0.5 mol/L 醋酸提取，結(jié)合NaCl沉淀法從鮟鱇魚(yú)皮中提取酸溶性膠原蛋白（ASC），凍干魚(yú)皮與0.1 mol/L NaOH以1:10（W/V）的料液比混合，磁力攪拌器攪拌24 h，用蒸餾水洗至樣液呈弱堿性。加入10%丁醇攪拌浸泡，用蒸餾水沖洗除盡丁醇后，加入0.5mol/L醋

21、酸溶液浸泡提取24h，離心，沉淀用醋酸溶液繼續(xù)提取24h，提取物也按上述方法處理。兩次提取、離心得到的上清液混合后用0.9mol/LNaCl鹽析，沉淀物以0.5mol/L醋酸溶液復(fù)溶、鹽析來(lái)達(dá)到提純膠原蛋白的目的。</p><p>　　1.1.2.3 堿法浸提</p><p>　　堿法提取膠原蛋白，常采用石灰、氫氧化鈉等處理劑。一般都是把樣品勻漿后，用堿溶液多次溶脹，然后再離心提取。關(guān)于

22、堿法提取膠原蛋白的報(bào)道相對(duì)較少，大多都是和其他提取方法結(jié)合使用。</p><p>　　1.1.2.4 熱水浸提</p><p>　　熱水提取法是先將原料經(jīng)除雜蛋白等前處理，然后在熱水中直接提取已經(jīng)變性的膠原蛋白或者膠原蛋白水解物[15]。李聞欣，楊明來(lái)等[16]研究了淡水魚(yú)鱗水法制膠原蛋白。結(jié)果表明：制膠條件為溫度60~70℃、時(shí)間2~3h。并通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)：溫度高些有助于提膠，但溫度過(guò)高

23、抽提率還有所下降。</p><p>　　1.1.2.5 結(jié)合法提取</p><p>　　由于季節(jié)的不同，不同水產(chǎn)品中含有羥脯氨酸與脯氨酸的量不同。而這兩種氨基酸的含量直接影響膠原蛋白的穩(wěn)定性，含量越高，膠原蛋白就越穩(wěn)定，則越難提取出來(lái)。所以可以考慮酸酶聯(lián)用來(lái)提取膠原蛋白。曾嶸等新鮮草魚(yú)魚(yú)鱗、魚(yú)鰭為原料將酸、堿法提取與酸、酶結(jié)合提取作了比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：用傳統(tǒng)的酸、堿提取法產(chǎn)率較低，然而酸酶

24、結(jié)合提取法除了有較高的產(chǎn)率，且反應(yīng)條件溫和，蛋白結(jié)構(gòu)不易被破壞。此外還有酸堿結(jié)合法，酸堿與熱水結(jié)合法等。結(jié)合法是現(xiàn)在很多研究者正在研究的工作，希望通過(guò)該法克服單一方法的不足，從而得到高提取率的膠原蛋白[17、18]。</p><p>　　1.1.2.6 其他方法在膠原蛋白提取中的應(yīng)用</p><p>　　另一些技術(shù)也逐漸應(yīng)用到膠原蛋白的提取當(dāng)中，例如高壓、微波[19]。莊永亮、李八方等[

25、20]研究了高壓輔助熱水提取海蜇膠原蛋白的工藝條件。以膠原蛋白得率（用羥脯氨酸含量計(jì)算）為指標(biāo)，分別研究了高壓功率、高壓處理的時(shí)間、熱水溫度以及熱水提取時(shí)間對(duì)膠原蛋白得率的影響，得到優(yōu)化的工藝條件：料液比l:4（W/V），高壓功率250MPa，高壓處理時(shí)間10 min，熱水處理溫度70℃，熱水提取時(shí)間1.5 h。此條件下，海蜇膠原蛋白的得率為68.2%。與傳統(tǒng)的膠原蛋白提取方法比較，高壓輔助提取方法操作工藝簡(jiǎn)單易控制，產(chǎn)品無(wú)小分子鹽摻入

26、，生產(chǎn)周期短，生產(chǎn)環(huán)保無(wú)污染。</p><p>　　1.1.3 膠原蛋白的應(yīng)用</p><p>　　膠原蛋白具有較強(qiáng)的生物活性和生物功能，能參與細(xì)胞的遷移、增殖和分化，使骨、腱、軟骨和皮膚具有一定程度的機(jī)械強(qiáng)度。同時(shí)膠原蛋白還能促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)，具有止血，生物相容性和生物降解性。因其具有這些性質(zhì)，膠原蛋白在創(chuàng)傷、燒傷、眼角膜疾病、美容、矯形、硬組織修復(fù)、創(chuàng)面止血等醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用

27、。</p><p>　　由于膠原蛋白及其水解物與人皮膚膠原的結(jié)構(gòu)相似，相容性較好，可以擴(kuò)散到皮膚深層，對(duì)人的皮膚有很好的營(yíng)養(yǎng)作用，且膠原蛋白分子外側(cè)存在大量的羧基和羥基，同時(shí)存在大量的甘氨酸等天然保濕因子，能夠提高組織細(xì)胞的貯水能力，使皮膚保濕；膠原蛋白溶液還有很強(qiáng)的抗輻射作用，因而膠原蛋白還廣泛應(yīng)用于化妝品行業(yè)[21-23]。膠原蛋白也可以作為功能食品和保健食品，也可以生產(chǎn)可食性包裝材料[24]。</p&

28、gt;<p>　　1.2 海蜇膠原蛋白的概述</p><p>　　近年來(lái)，由于瘋牛病等疾病的暴發(fā)以及宗教因素的影響[25]，人們開(kāi)始尋求從水產(chǎn)動(dòng)物中提取膠原蛋白。我國(guó)海蜇資源豐富，因此，如能從海蜇廢棄物中提取膠原蛋白加以利用，既能促進(jìn)海蜇加工廢棄物的綜合利用，又能開(kāi)發(fā)一種新的膠原蛋白源。</p><p>　　1.2.1 海蜇的生物學(xué)特性</p><p&

29、gt;　　海蜇(Rhopilem esculentum)，又稱(chēng)為刺胞動(dòng)物，屬腔腸動(dòng)物門(mén)、缽水母綱、根口水母目、海蜇屬[26]，是暖水沿岸物種，在海洋內(nèi)分布廣泛。海蜇在海洋中營(yíng)浮游生活，棲息于近岸水域，喜居河口附近，主要分布于中國(guó)、日本、朝鮮半島沿岸及俄羅斯遠(yuǎn)東海域。海蜇體呈傘蓋狀，通體半透明，白色、青色或微黃色，傘徑超過(guò)45cm，最大可達(dá)1m，呈半球形，上傘隆起，中膠層發(fā)達(dá)；下傘較薄，邊緣具發(fā)達(dá)環(huán)肌，能收縮運(yùn)動(dòng)[27]。</p&g

30、t;<p>　　1.2.2 海蜇膠原蛋白的研究進(jìn)展</p><p>　　海蜇除可食用外，全身都可入藥，根據(jù)《本草綱目》所述，海蜇“氣味咸溫?zé)o毒、主治婦人勞損、積血帶下，小兒風(fēng)疾丹毒，燙火傷”，對(duì)哮喘、氣管炎、胃潰瘍、單純性甲狀腺腫大、高血壓等癥均有療效[26、28]。新鮮海蜇含水量約為96%，蛋白質(zhì)含量約2.92%，脂肪含量小于0.01%。除水外，蛋白質(zhì)是海蜇的主要成分，而且主要是膠原蛋白[26]

31、。因此海蜇的藥理功能與其蛋白質(zhì)組成必然有一定的聯(lián)系，已有研究表明，從海蜇中提取的膠原蛋白可用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。因此對(duì)海蜇的膠原蛋白及其氨基酸組成進(jìn)行測(cè)定也是很有必要的，這將有助于海蜇的營(yíng)養(yǎng)評(píng)價(jià)和保健功能的研究。</p><p>　　莊永亮等[29]研究海蜇傘部胃蛋白酶促溶性膠原蛋白的提取及其部分理化性質(zhì)，氨基酸組成及SDS-PAGE顯示，海蜇傘部膠原蛋白(PSC)為Ⅰ型膠原蛋白；含糖量為2.8%；熱變性溫度和熱

32、收縮溫度分別為28.8℃和51.6℃，均低于牛皮Ⅰ型膠原；紅外光譜顯示PSC保留了大量的三股螺旋結(jié)構(gòu)；溶解性表明PSC 的等電點(diǎn)為pH6，在pH3 時(shí)有最大溶解度；酸性條件下鹽濃度高于4%(m/V)時(shí)，PSC的溶解度急劇下降。安桂香對(duì)新鮮海蜇的頭部和腕部進(jìn)行了氨基酸成分的分析，海蜇的蛋白占其干重的50%，其氨基酸成分種類(lèi)齊全，必須氨基酸含量豐富。分別用酸性蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶以及復(fù)合酶對(duì)海蜇的蛋白部分進(jìn)行了酶

33、解，確定出堿性蛋白酶酶解的最適反應(yīng)條件為酶用量。金桂芬等分別采用酸法和酶法從海蜇提取膠原蛋白，結(jié)果表明，酶法提取相對(duì)于酸法提取可獲得較高含量的膠原蛋白。</p><p>　　1.3 研究的目的和意義</p><p>　　如今海蜇養(yǎng)殖業(yè)得興起和發(fā)展為膠原蛋白的提取豐富了新的原料來(lái)源，且海蜇經(jīng)加工后產(chǎn)生的大量廢棄物是制備高蛋白食物的優(yōu)良原料，開(kāi)發(fā)利用廢棄物也有利于提高海蜇的附加值。從海蜇中提

34、取得到的膠原蛋白因其特殊的氨基酸組成及理化性質(zhì)而具有獨(dú)特的生理功能，包括抗菌、抗過(guò)敏、降血壓、降膽固醇、抗衰老、治療關(guān)節(jié)炎癥和保健等功效[30]，可用作藥品、食品、化妝品等相關(guān)制品原料。隨著科技進(jìn)步、經(jīng)濟(jì)發(fā)展和生活質(zhì)量的普遍提高，人們崇尚綠色、回歸自然意識(shí)的增強(qiáng)，高附加值海蜇膠原蛋白將越來(lái)越受到人們的廣泛青睞。</p><p>　　本文采用胃蛋白酶提取海蜇中的酶溶性膠原蛋白，考察了提取時(shí)間、酶用量、液料比對(duì)酶法提

35、取率的影響，再結(jié)合響應(yīng)面分析得出膠原蛋白提取的工藝優(yōu)化條件。同時(shí)也對(duì)提取的膠原蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行分析：氨基酸分析、紅外光譜分析、紫外光譜分析，為海蜇酶溶性膠原蛋白的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。</p><p><b>　　2 材料與方法</b></p><p>　　2.1 材料與試劑</p><p>　　海蜇，購(gòu)于浙江省岱山縣水產(chǎn)市場(chǎng)；</p&

36、gt;<p>　　L-羥脯氨酸，購(gòu)于Sigma公司；</p><p>　　檸檬酸鈉、氫氧化鈉、檸檬酸、氯胺T、對(duì)二甲基氨基苯甲醛、冰乙酸、乙二醇獨(dú)甲醚、濃硫酸、高氯酸、鹽酸、無(wú)水乙醇、溴化鉀、醋酸、溴酚藍(lán)、乙醚、戊巴比妥鈉，均為AR級(jí)，購(gòu)于寧波奧博科學(xué)儀器有限公司；</p><p>　　胃蛋白酶，由國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供；</p><p>　　十

37、二烷基硫酸鈉、過(guò)硫酸胺、丙烯酰胺、β-巰基乙醇、考馬斯亮藍(lán)R-25，購(gòu)自上海生物工程有限公司；</p><p>　　相關(guān)實(shí)驗(yàn)試劑的配置：</p><p>　　檸檬酸緩沖液：檸檬酸鈉120g、冰醋酸12mL、檸檬酸46g、氫氧化鈉34g溶解于蒸餾水中，調(diào)整pH值至6.0，然后定容至1000mL；</p><p>　　0.05mol/L氯胺T溶液：稱(chēng)取氯胺T 7.05g

38、，溶解于100mL蒸餾水中，然后加入乙二醇獨(dú)甲醚150 mL，再加入250mL檸檬酸緩沖液混合均勻；</p><p>　　對(duì)二甲基氨基苯甲醛：試劑A：取無(wú)水乙醇20mL，慢慢加入濃硫酸2.74mL；試劑B：取對(duì)二甲基氨基苯甲醛12.0g，慢慢加入無(wú)水乙醇40mL，水浴加熱使其完全溶解并冷卻至室溫，然后將A液慢慢加入B，混合均勻；</p><p>　　3.5 mol/L高氯酸溶液：取27mL

39、高氯酸，以蒸餾水定容到100mL。</p><p>　　2.2 儀器與設(shè)備</p><p>　　臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（Heraeus，德國(guó)科峻儀器公司）</p><p>　　真空冷凍干燥機(jī)（Freezing Dry，美國(guó)LABCONCO公司）</p><p>　　可見(jiàn)分光光度計(jì)（T6新悅，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）</p>

40、<p>　　傅里葉紅外光譜儀（TENSOR 27型，德國(guó)Bruker公司）</p><p>　　紫外分光光度計(jì)（Cary50，美國(guó)Varian公司）</p><p>　　液相色譜儀（Agilent1200，美國(guó)安捷倫科技公司）</p><p>　　微波消解系統(tǒng)（MARS，美國(guó)CEM公司）</p><p><b>　　2.3

41、 方法</b></p><p>　　2.3.1 工藝流程</p><p>　　采樣→前處理→酸溶性膠原蛋白提取后的沉淀→酸萃?。用福x心→上清液→鹽析→透析→PSC濃縮液→冷凍干燥</p><p>　　2.3.2 樣品的前處理</p><p>　　將海蜇頭和海蜇皮分離，用蒸餾水浸泡洗滌海蜇皮以去除鹽分并瀝干，切成小塊，用

42、20倍體積0.5%的氫氧化鈉溶液浸泡2h左右，再用蒸餾水沖洗至中性，瀝干留以備用。</p><p>　　2.3.3 酶溶性膠原蛋白的提取</p><p>　　膠原存在的原始狀態(tài)為：中間是規(guī)則的三股螺旋區(qū)域，兩端是非螺旋區(qū)，非螺旋區(qū)是導(dǎo)致膠原蛋白不溶的根源，因此需要采用合適的方法去除非螺旋區(qū)。本實(shí)驗(yàn)選擇胃蛋白酶作為催化劑，在酸性條件下作用與膠原端肽非螺旋區(qū)，有選擇性的切斷苯丙氨酸、亮氨酸或

43、谷氨酸羧基側(cè)的肽鍵，將非螺旋區(qū)去除，則含三螺旋結(jié)構(gòu)的主體部分可溶解有機(jī)酸而以近完整分子的形式釋放出來(lái)，從而提高膠原蛋白溶解量。</p><p>　　實(shí)驗(yàn)步驟如下：取一定量搗碎均勻的海蜇，先用醋酸提取酸溶性膠原蛋白。提取后的沉淀，加入適量0.5mol/L醋酸，加入胃蛋白酶，浸提一定時(shí)間后，在10000r/min離心30min，離心后得到的上清液即為酶促溶性膠原蛋白粗制液，再加入NaCl使?jié)舛葹?.9mol/L，攪拌

44、后再次在10000r/min離心30min，并將離心得到的沉淀溶于少量的0.5mol/L醋酸，再轉(zhuǎn)入透析袋對(duì)去離子水透析2d，冷凍干燥即得酶促溶性膠原蛋白（PSC）制品。以上操作都在低溫（4℃）下進(jìn)行。</p><p>　　2.3.4 膠原蛋白提取率的測(cè)定</p><p>　　膠原蛋白含有大量的甘氨酸，脯氨酸，羥脯氨酸，羥賴氨酸，其中羥脯氨酸（Hyp)和羥賴氨酸在其它蛋白中很少見(jiàn)，為膠原

45、蛋白所特有。通過(guò)測(cè)定羥脯氨酸的含量，然后乘以相應(yīng)的系數(shù)可以得到膠原蛋白的含量。</p><p>　　膠原蛋白得率（%）=11.1×A×稀釋倍數(shù)/M×100</p><p>　　M：海蜇質(zhì)量（mg）</p><p>　　A：羥脯氨酸含量（mg）</p><p>　　羥脯氨酸通過(guò)分光光度計(jì)來(lái)測(cè)量。首先配置羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)

46、工作液，準(zhǔn)確稱(chēng)取L-羥基脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)品11mg，加入0.01mol/L鹽酸中溶解，稀釋并定容到100mL，濃度為110μg/ mL，在冰箱中保存。</p><p>　　吸取羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作液1.0、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5mL，分別用蒸餾水定容到100mL。以蒸餾水為空白，分別吸取上述標(biāo)準(zhǔn)液1mL，加入1mL檸檬酸緩沖液和1mL 0.05mol/L氯胺T溶液，25℃氧化10min后，加入高氯酸

47、1mL（3.5mol/L），放置10min，加入對(duì)二甲基氨基苯甲醛試劑1mL，在65℃水浴顯色10min，冷卻后在560nm處測(cè)吸光度。以羥脯氨酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。測(cè)定樣品在560nm處得吸光度，查標(biāo)準(zhǔn)曲線得樣品的羥脯酸含量。</p><p>　　2.3.5 單因素的確定</p><p>　　2.3.5.1 提取時(shí)間的選擇</p><p&

48、gt;　　在酶濃度2%，液料比為20，4℃條件下提取膠原蛋白，提取結(jié)束后，離心，濃縮干燥。研究提取時(shí)間分別為12h、34h、36h、48h和60h對(duì)海蜇膠原蛋白得率的影響。</p><p>　　2.3.5.2 液料比的確定</p><p>　　在酶濃度2%，提取時(shí)間為36h，4℃下液料比分別為5、10、15、20、25和30時(shí)，測(cè)定膠原蛋白的提取率。</p><p&g

49、t;　　2.3.5.3 酶濃度的選擇</p><p>　　提取時(shí)間36h，液料比為15，酶濃度分別為0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%和4%，確定酶濃度與膠原蛋白提取率的關(guān)系。</p><p>　　2.3.6 提取工藝參數(shù)優(yōu)化</p><p>　　在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，確定Box-Behnken設(shè)計(jì)的自變量，以膠原蛋白的提取得率為響應(yīng)值，通

50、過(guò)響應(yīng)曲面分析進(jìn)行提取條件的優(yōu)化。</p><p>　　2.3.7 膠原蛋白的理化分析</p><p>　　2.3.7.1 氨基酸分析</p><p>　　氨基酸分析采用高效液相色譜法。各氨基酸組分由于極性，等電點(diǎn)或分子大小的不同，先后分別被洗脫。稱(chēng)取一定量膠原蛋白樣品于四氟乙烯消解罐中，加入6 mol/LHCL，進(jìn)行消解，消解程序見(jiàn)表1。消解結(jié)束后調(diào)節(jié)pH值至

51、7.2，定容至25mL，取1mL過(guò)0.22μm微孔濾膜，備用。</p><p>　　儀器工作條件是Hypersil AA-ODS 2.1×200mm×5μm氨基酸柱，進(jìn)樣量為2 μL，流速為0.45 mL/min，柱溫為40℃，后運(yùn)行時(shí)間為2min，VWD檢測(cè)器波長(zhǎng)為338nm。流動(dòng)相A為20mmol/L醋酸鈉溶液，pH=7.20±0.05；流動(dòng)相B為醋酸鈉，乙腈，甲醇混合液，體積比

52、為100mmol/L醋酸鈉溶液：乙腈：甲醇=20:40:40，pH=7.20±0.05；衍生化試劑分別為OPA（鄰苯二甲醛）和FMOC（9-氯甲酸芴甲酯）。</p><p><b>　　表1 樣品消解程序</b></p><p>　　Tab.1 Sample hydrolysis process</p><p>　　2.3.7.2

53、 紫外光譜分析</p><p>　　用蒸餾水將制備的海蜇膠原蛋白溶解，在200nm-400nm的近紫外光區(qū)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描。</p><p>　　2.3.7.3 紅外光譜分析</p><p>　　利用膠原蛋白肽鍵中的分子結(jié)構(gòu)與紅外光譜吸收帶的波長(zhǎng)位置與吸收譜帶的吸收強(qiáng)度相對(duì)應(yīng)的特點(diǎn)[31]，采用傅立葉變換紅外光譜對(duì)膠原蛋白進(jìn)行透射掃描。在紅外燈照射下將少量樣品和適量

54、的干燥的KBr，混合均勻并研成分粉末狀。取少許樣品壓片，全反射光譜測(cè)定法（ATR）進(jìn)行測(cè)定。傅里葉紅外光譜儀在4000~400cm-1范圍內(nèi)掃描，分辨率設(shè)置為4cm-1。</p><p><b>　　3 結(jié)果與分析 </b></p><p>　　3.1 羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制</p><p>　　根據(jù)測(cè)定的數(shù)值，以羥脯氨酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，

55、吸光值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（見(jiàn)圖1），求出回歸方程y=0.0979+0.0043，R2=0.9988，曲線線性良好。</p><p>　　圖1 羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線</p><p>　　Fig.1 The standard curve of Hyp</p><p>　　3.2 提取時(shí)間對(duì)酶溶性膠原蛋白提取率的影響</p><p>　　在酶濃度2

56、%，液料比為20，4℃條件下分別設(shè)定水解時(shí)間為12h、34h、36h、48h和60h來(lái)研究膠原蛋白的提取率與反應(yīng)時(shí)間的關(guān)系，結(jié)果見(jiàn)圖2，可以看出隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，膠原蛋白的提取率也隨之增加，當(dāng)時(shí)間到36h時(shí)，提取率達(dá)到最大，而后提取率有所下降，因此提取時(shí)間確定為36h。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，提取的膠原蛋白含量不斷增加，36h到達(dá)最大值，但隨著時(shí)間的繼續(xù)延長(zhǎng)，底物不斷減少，胃蛋白酶開(kāi)始作用膠原蛋白，使得膠原蛋白含量開(kāi)始減少。</p>

57、;<p>　　圖2 時(shí)間對(duì)膠原蛋白提取的影響</p><p>　　Fig.2 Effect of extraction time on the jellyfish collagen</p><p>　　3.3 液料比對(duì)膠原蛋白提取率的影響</p><p>　　在考察液料比的影響時(shí)，我們采用液料比分別為5、10、15、20、25和30，測(cè)定膠原蛋白

58、的提取率，結(jié)果見(jiàn)圖3。從中可以看出隨著液料比的增加，提取率也隨之增加，這主要是由于液料比的增加促使組織不斷膨脹，打開(kāi)含有醛胺類(lèi)得交聯(lián)鍵，更有利于酶解的進(jìn)行。當(dāng)達(dá)到15時(shí)，提取率又下降，因此確定最佳液料比為15（v:m）。液料比較小時(shí)，海蜇不能完全浸于其中，提取率低，液料比變大，膠原蛋白提取率變小，原因可能是液料比大造成膠原蛋白分離純化困難，損失較多。</p><p>　　圖3 液料比對(duì)膠原蛋白提取的影響</

59、p><p>　　Fig.3 Effect of water/solid ratoi on the jellyfish collagen</p><p>　　3.4 胃蛋白酶濃度對(duì)膠原蛋白提取率的影響</p><p>　　酶濃度是影響膠原蛋白產(chǎn)率的重要因素，如果酶濃度過(guò)低，則底物反應(yīng)不充分；而酶濃度過(guò)高則會(huì)引起分子之間的相互作用，阻止酶解反應(yīng)的順利進(jìn)行。本實(shí)驗(yàn)研究了在

60、提取時(shí)間36h、液料比為15時(shí)，酶濃度分別為0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%和4%對(duì)膠原蛋白產(chǎn)率的影響，結(jié)果如圖4所示。PSC得率隨著酶濃度的增加而提高，當(dāng)酶濃度大于3.5%時(shí)，提取率有所降低，因此確定酶濃度為3.5%。</p><p>　　圖4 酶濃度對(duì)膠原蛋白提取的影響</p><p>　　Fig.4 Effect of enyzme concentratio

61、n on the jellyfish collagen</p><p>　　3.5 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果</p><p>　　在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，確定最佳提取時(shí)間為36h，液料比為15，酶濃度為3.5%，設(shè)計(jì)三因素三水平的實(shí)驗(yàn)見(jiàn)表2。響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表3，15個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)分為析因點(diǎn)和零點(diǎn)，其中析因點(diǎn)為自變量取值在A、B、C所構(gòu)成的三維頂點(diǎn)；零點(diǎn)為區(qū)域的中心點(diǎn)，零點(diǎn)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次（13

62、、14、15），用以估計(jì)試驗(yàn)誤差。</p><p>　　表2 響應(yīng)面分析因素及水平</p><p>　　Tab. 2 Factors and levels of response surface experiment</p><p>　　表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果</p><p>　　Tab.3 Design and results o

63、f response surface experiment</p><p>　　根據(jù)表3的結(jié)果，通過(guò)響應(yīng)面回歸程序進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，得出回歸模型，回歸方程為：</p><p>　　Y=0.402333＋0.007125A＋0.0125B＋0.019625C＋0.00825AB＋0.003AC ＋0.01825BC－0.01942A2－0.01967B2－0.00442C2</p>

64、<p>　　模擬的可靠性可通過(guò)方差分析及相關(guān)系數(shù)來(lái)考察，見(jiàn)表4。</p><p>　　根據(jù)回歸分析結(jié)果（表4）做出響應(yīng)面圖（a）和等高圖（b）見(jiàn)圖4、圖5及圖6。</p><p>　　(a) (b)</p><p>　　圖4 提取時(shí)間和液料比對(duì)膠原得率的響應(yīng)面圖</p>

65、<p>　　Fig.4 Response surface plots of extract time and water/solid ratio</p><p>　　(a) (b)</p><p>　　圖5 提取時(shí)間和加酶量對(duì)膠原得率的響應(yīng)面圖</p><p>　　Fig.5 Respo

66、nse surface plots of extract time and enzyme concentration</p><p>　　(a) (b)</p><p>　　圖6 液料比和加酶量對(duì)膠原得率的響應(yīng)面圖</p><p>　　Fig.6 Response surface plots o

67、f water/solid ratio and enzyme concentration</p><p>　　從圖4可以看出，當(dāng)提取時(shí)間一定時(shí)，提取率隨著液料比的增加而變大，達(dá)到一定程度時(shí)提取率又降低，這說(shuō)明液料比或大或小都會(huì)影響膠原蛋白的提取率，當(dāng)液料比大時(shí)，對(duì)膠原蛋白的提取和純化都帶來(lái)一定的困難，液料比小時(shí)，膠原蛋白又不能完全浸于其中。當(dāng)液料比一定時(shí)，提取率也隨時(shí)間的延長(zhǎng)增大隨后又降低。從圖5中可以看出，提取

68、時(shí)間一定，提取率隨加酶量的增加而變大，其后變化較緩慢。從圖6中看出，加酶量一定，提取率隨液料比的增加而先變大后變小。液料比一定時(shí)，提取率隨加酶量的增加而增加。</p><p>　　當(dāng)“Prob＞F”值小于0.05級(jí)表示指標(biāo)顯著。從表4的分析結(jié)果可看出，整體模型的“Prob＞F”值小于0.05，表明該回歸方差模型是顯著的，并且失擬項(xiàng)不顯著，說(shuō)明該模型的擬合度較好；從回歸方程各項(xiàng)方差的進(jìn)一步檢驗(yàn)可看出，液料比和酶濃度

69、的一次項(xiàng)的影響是顯著的，提取時(shí)間和液料比的二次項(xiàng)的影響也是顯著的，交互項(xiàng)作用影響不顯著，說(shuō)明各因素對(duì)海蜇膠原蛋白提取率的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，表明回歸方程能夠很好地模擬真實(shí)的曲面。因此，回歸方程可以較好地描述各因素與響應(yīng)值之間的真實(shí)關(guān)系，可以利用該回歸方程確定最佳提取工藝條件：4℃條件下提取時(shí)間為41.4h，液料比為19.4:1，酶濃度為4%，在此條件下海蜇膠原蛋白的預(yù)測(cè)提取率為0.43%。為了驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的可靠性，將酶促溶性膠原蛋白最優(yōu)

70、提取條件修正為提取時(shí)間41h，底物濃度為19:1，酶濃度為4%，在此條件下測(cè)定的膠原蛋白的提取率為0.411%，與預(yù)測(cè)值的誤差為4.42%。以此可以看出，響應(yīng)面優(yōu)化的最佳提取工藝較為可靠。</p><p>　　表4 酶法提取方差分析表</p><p>　　Tab.4 The table of variance analysis in pepsin-extraction</p>

71、<p>　　3.6 氨基酸組成</p><p>　　膠原蛋白的氨基酸組成見(jiàn)表5。從中可以看出通過(guò)酶法提取的海蜇膠原蛋白的氨基酸含有7種為人體必需的氨基酸（色氨酸水解過(guò)程中被破壞，未被檢測(cè)到)。甘氨酸、天冬氨酸、谷氨酸的含量較高，其中甘氨酸占總量的22%；而酪氨酸、賴氨酸等含量較少。</p><p>　　表5 膠原蛋白的氨基酸含量(mg/g)</p><p&

72、gt;　　Tab.5 Contents of amino acids in Collagen (mg/g)</p><p>　　注，*：必需氨基酸；TEAA：總必須氨基酸量；TAA：總氨基酸量；－：未檢出</p><p>　　Note, *: essential amino acid; TEAA: total essential amino acids; TAA: total amino

73、 acids; －: Undetected</p><p>　　3.7 紫外光譜分析</p><p>　　一般具有共軛雙鍵的物質(zhì)都具有紫外吸收，在20種基本氨基酸中，Trp、Tyr、Phe和His4種是具有共軛雙鍵的，而這其中Trp的紫外吸收最厲害，在280nm的紫外吸收較強(qiáng)，所以大多數(shù)蛋白質(zhì)在280nm都有一個(gè)很強(qiáng)的紫外吸收，并可通過(guò)對(duì)280nm的紫外吸收度的測(cè)量對(duì)蛋白質(zhì)溶液進(jìn)行定量分

74、析，但膠原蛋白由于幾乎不含Trp，所以在280nm沒(méi)有強(qiáng)吸收峰的出現(xiàn)，這可以作為一個(gè)鑒定膠原蛋白的方法。從圖7可知，膠原蛋白在208nm處有一個(gè)吸收峰，而在280nm處沒(méi)有顯著吸收，這表明所提取的酶溶性膠原蛋白純度很高。</p><p>　　圖7 PSC紫外吸收光譜</p><p>　　Fig.7 UV absorption spectra of PSC</p><

75、p>　　3.8 紅外光譜分析</p><p>　　使用傅立葉變換紅外光譜儀測(cè)得海蜇PSC的紅外圖譜如圖8所示。</p><p>　　圖8 PSC紅外光譜圖</p><p>　　Fig.8 Fourier transform infrared spectrum of PSC</p><p>　　對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分析，可以獲知傅立葉變換紅

76、外光譜圖中蛋白質(zhì)的吸收峰位置、振動(dòng)方式以及譜帶歸屬（見(jiàn)表6）。</p><p>　　表6 PSC紅外光譜歸屬</p><p>　　Tab.6 FTIR band assignments of PSC</p><p>　　譜圖中相應(yīng)的特征波數(shù)符合膠原的吸收峰位，證明所制得的為膠原蛋白。據(jù)表6可知，N-H伸縮振動(dòng)的吸收峰出現(xiàn)在3400~3440cm-1處，樣品PS

77、C的酰胺A出現(xiàn)在3423.14cm-1。2933.31cm-1的弱吸收為酰胺B的C-H伸縮引起的特征吸收峰。酰胺Ⅰ帶的特征吸收頻率為1600~1700cm-1，是由蛋白多肽骨架的C=O伸縮引起，其吸收最強(qiáng)，常被用于蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析，海蜇PSC的酰胺Ⅰ帶出現(xiàn)在1656.60cm-1。1480~1600cm-1為酰胺Ⅱ帶的特征吸收頻率，主要為膠原蛋白的C-N伸縮與N-H彎曲的反映，海蜇膠原蛋白的酰胺Ⅱ帶的特征吸收為1550.05cm-1

78、處得強(qiáng)吸收。在膠原的紅外譜圖上1235cm-1~1450cm-1范圍內(nèi)存在吸收，可以作為檢測(cè)膠原的三股螺旋結(jié)構(gòu)是否保持完整的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)，紅外光譜圖譜證明海蜇膠原蛋白的三股螺旋結(jié)構(gòu)完整。</p><p><b>　　4 小結(jié)</b></p><p>　　通過(guò)單因素和響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，得到酶法提取膠原蛋白的最佳工藝為：提取時(shí)間41h，底物濃度為19:1，酶濃度為4%，在此條件下

79、測(cè)定的膠原蛋白的提取率為0.411%，與預(yù)測(cè)值的誤差為4.42%。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)海蜇中含有豐富的膠原蛋白，是一個(gè)潛在的膠原蛋白源。通過(guò)氨基酸分析可知海蜇膠原蛋白中甘氨酸含量最高，占氨基酸總量的22%。紫外分析可知PSC的最大吸收峰在208nm，而在208nm處沒(méi)有吸收峰出現(xiàn)，說(shuō)明用胃蛋白酶制得的膠原蛋白純度較高。紅外分析證明了海蜇膠原蛋白的三股螺旋結(jié)構(gòu)完整。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)</b&

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