鼠傷寒沙門菌鞭毛蛋白作為免疫佐劑的研究.pdf

1、鞭毛是沙門菌運動性的基礎結構，鞭毛蛋白是鞭毛絲狀部組成元件。鞭毛蛋白被認為是一種保護性抗原用于針對沙門菌的疫苗研究，同時它還是Toll樣受體5(Toll-like receptor5，TLR5)的配體，與之結合后可誘導產生天然免疫應答。近年來研究結果表明，鞭毛蛋白作為天然免疫應答的誘導劑，誘導產生的天然免疫應答可幫助建立針對外源抗原的獲得性免疫應答，從而顯示出鞭毛蛋白作為免疫佐劑的特性。
　　 禽流感(Avian influen

2、za,AI)是由正黏病毒科、流感病毒屬、A型流感病毒引起的一種禽類的急性高度接觸性、致死性傳染病，被國際獸疫局(OIE)列為法定通報疾病。由于近年來包括H5N1亞型在內的一些禽流感病毒能夠跨種感染人并引起人類疾病，所以引起了各國醫(yī)學和獸醫(yī)學界的廣泛關注?；|蛋白2(M2)是禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)表面的第三大跨膜蛋白，它在禽流感病毒各亞型的不同毒株之間都具有很高的同源性。研究結果表明，M2蛋白具有

3、較好的抗原性，且其主要抗原決定簇位于M2蛋白的胞外區(qū)M2e。
　　 新城疫(Newcastle disease，ND)是危害養(yǎng)禽業(yè)的主要傳染病之一，被OIE確定為法定通報疾病，免疫預防是控制該病的重要手段之一。位于新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)囊膜上的融合蛋白(F)除了參與病毒的穿透、細胞融合，與病毒的致病性有關外，還具有良好的免疫原性，是NDV主要的保護性抗原。
　　 為此，本研究

4、以鼠傷寒沙門菌鞭毛蛋白作為研究對象，構建了展呈AIV M2e表位的重組嵌合鞭毛蛋白，以及鞭毛蛋白與NDV F蛋白部分表位串聯(lián)表達的融合蛋白，并分別對它們的免疫原性進行了初步的分析，以期分析該鞭毛蛋白的免疫佐劑效應。
　　 1.鞭毛蛋白展呈禽流感病毒M2e表位及其免疫原性分析
　　 以重組質粒pET-fliC為模板，應用引物fliC-A、fliC-C擴增fliC基因上游部分fliC-AC；引物fliC-D、fliC-B擴增

5、fliC基因下游部分fliC-DB；人工合成兩個拷貝的H5N1亞型禽流感病毒M2e(aa2-24)表位基因M2e2，利用overlap PCR技術，以fliC-AC和M2e2基因為模板，應用引物fliC-A、M2-F擴增fliC-AC-M2e2基因片段；最后以fliC-AC-M2e2和fliC-DB為模板，應用引物fliC-A、fliC-B擴增嵌合基因片段fliC/M2e2，從而將M2e2基因插入沙門菌鞭毛蛋白基因fliC高變區(qū)。將嵌合

6、基因片段fliC/M2e2克隆到質粒pET30a+上，獲得重組質粒pET-fliC/M2e2。
　　 將質粒pET-fliC/M2e2通過電轉化法轉化鼠傷寒沙門菌LB5000，重組菌命名為LB5000(fliC/M2e2)。應用P22噬菌體轉導技術，將fliC/M2e2基因導入都柏林沙門菌SL5928的基因組中，對初篩具有運動性的轉導菌進行PCR鑒定，以轉導菌全基因組為模板，擴增fliC/M2e2基因和M2e2基因；PCR鑒定結

7、果陽性的轉導菌再穿刺半固體培養(yǎng)基，進行動力學分析并對轉導菌進行透射電鏡觀察；動力學分析結果陽性的轉導菌再進行生化鑒定和血清學鑒定；最后，提取鑒定結果陽性的轉導菌的鞭毛蛋白，以鼠抗鼠傷寒沙門菌fliC鞭毛蛋白多抗血清為一抗，對提取的鞭毛蛋白進行Western blot分析。將以上所有鑒定結果均為陽性的轉導菌命名為SL5928(fliC/M2e2)。
　　 提取重組菌SL5928(fliC/M2e2)的重組嵌合鞭毛蛋白fliC/M2

8、e2，以50μg/只的劑量通過皮下注射途徑免疫C3H/HeJ小鼠。ELISA檢測各免疫組小鼠針對M2e2蛋白的特異性血清抗體，并對結果進行統(tǒng)計學分析。結果顯示，二免第14天，fliC/M2e2鞭毛蛋白免疫組的抗體效價與空白對照組之間呈現(xiàn)顯著性差異(P＜0.05)，fliC鞭毛蛋白免疫組和M2e蛋白免疫組與空白對照組之間不呈現(xiàn)顯著性差異(P＞0.05)。說明本研究所構建的fliC/M2e2嵌合基因能夠在沙門菌中表達，且表達的重組嵌合鞭毛蛋

9、白fliC/M2e2能誘導機體產生針對M2e表位的特異性血清抗體。
　　 2.鞭毛蛋白與新城疫病毒F蛋白的融合表達及其產物對小鼠的免疫原性分析
　　 以重組質粒pET-fliC為模板，應用引物FF1、FF2擴增鼠傷寒沙門菌鞭毛蛋白fliC基因；以重組質粒pVAX1-F為模板，應用引物FF3、FF4擴增含有新城疫病毒(Newcastledisease virus，NDV)F蛋白部分表位的基因片段F(aa147-344)；通

10、過柔性肽(Gly4Ser)2編碼基因將fliC基因和F基因串聯(lián)，獲得fliC-F基因片段；將fliC-F基因克隆到原核表達質粒pET30a+上，獲得重組原核表達質粒pET-fliC-F。
　　 將重組原核表達質粒pET-fliC-F轉化原核表達菌E.coli BL21(DE3)，獲得重組原核表達菌BL21(DE3)(pET-fliC-F)。對重組原核表達菌BL21(DE3)(pET-fliC-F)進行誘導表達，對表達蛋白進行變性

11、、復性、透析和濃縮，獲得可溶性fliC-F融合蛋白。以鼠抗fliC蛋白或鼠抗F蛋白多抗血清作為一抗，對fliC-F融合蛋白進行Western blot分析。分析結果顯示，兩種多抗血清均能特異性識別fliC-F融合蛋白。說明，fliC-F融合蛋白中的fliC蛋白和F蛋白成分能獨立地保持各自的天然構象。
　　 將fliC-F融合蛋白以100μg/只的劑量，通過皮下注射途徑免疫C3H/HeJ小鼠。ELISA檢測各免疫組小鼠針對F蛋白的

12、特異性血清抗體，并對結果進行統(tǒng)計學分析。結果顯示，二免第14天和二免第21天，fliC-F蛋白免疫組的抗體效價與空白對照組之間呈現(xiàn)顯著性差異(P＜0.05)；二免第14天，F(xiàn)蛋白油乳劑免疫組的抗體效價與空白對照組之間也呈現(xiàn)顯著性差異(P＜0.05)；F蛋白免疫組和fliC蛋白免疫組與空白對照組之間，在各階段均不呈現(xiàn)顯著性差異(P＞0.05)。結果說明，本研究中原核表達的fliC-F融合蛋白能誘導C3H/HeJ小鼠產生針對F蛋白的特異性血