山東省番茄黃化曲葉病毒的遺傳多樣性及種群結(jié)構(gòu).pdf

1、番茄黃化曲葉病毒(Tomatoyellowleafcurlvirus,TYLCV)隸屬雙生病毒科(Geminiviridae)中的菜豆金色花葉病毒屬(Begomovirus),由煙粉虱(Bemisiatabaci)傳播。該病毒引起的番茄黃化曲葉病(Tomatoyellowleafcurldisease,TYLCD)幾乎遍及所有熱帶和亞熱帶地區(qū),危害嚴(yán)重,已成為世界番茄產(chǎn)業(yè)的主要限制性因素之一。TYLCV于2006年在我國(guó)首次報(bào)道后急速蔓

2、延,隨后在多個(gè)省市大面積爆發(fā),2008年在山東聊城、壽光、臨淄等多個(gè)地市發(fā)現(xiàn)TYLCV的嚴(yán)重危害,受災(zāi)面積達(dá)95%,減產(chǎn)55%左右。為了弄清侵染山東番茄的雙生病毒種類,為進(jìn)一步開(kāi)展該病毒病害的防控研究提供理論依據(jù),我們?cè)谏綎|棗莊、菏澤、臨沂、泰安、濟(jì)南、淄博、濰坊、德州和濱州等9個(gè)區(qū)市的番茄主產(chǎn)區(qū)采集了140個(gè)疑似TYLCV侵染的番茄樣本,對(duì)其進(jìn)行了病原分子鑒定和變異分析。
　　 利用雙生病毒簡(jiǎn)并引物PA/PB在107個(gè)樣品中P

3、CR擴(kuò)增得到約500bp的特異片段,在棗莊、菏澤、臨沂、泰安、濟(jì)南、淄博、濰坊、德州和濱州等地區(qū)番茄上雙生病毒的檢出率分別為91.7%,54.5%,66.7%,62.5%,75.0%,71.4%,85.0%,100%和80.0%。隨機(jī)選取2個(gè)陽(yáng)性樣品對(duì)該片段進(jìn)行克隆測(cè)序,經(jīng)序列比較發(fā)現(xiàn)這2個(gè)片段之間的相似性為98.5%,與已報(bào)道的TYLCV各分離物相應(yīng)片段的相似性都在94%以上。隨機(jī)選取其中4個(gè)不同區(qū)市分離物SD11、SD28、SD39

4、和SD65,對(duì)其DNA-A全基因組進(jìn)行了克隆和序列分析,結(jié)果表明,4個(gè)DNA-A全長(zhǎng)分子均為2781nts,具有典型的Begomovirus屬病毒的基因組結(jié)構(gòu)特征,且與我國(guó)上海、安徽等地報(bào)道的TYLCV分離物相似性均在98.5%以上,表明它們是TYLCV的分離物。設(shè)計(jì)TYLCV特異性引物TYT-F/TYT-R對(duì)140個(gè)樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增,從107個(gè)樣品中均擴(kuò)增到430bp大小的目的條帶,檢出率及檢出的樣品編號(hào)與PA/PB檢測(cè)結(jié)果相吻合。

5、PCR檢測(cè)表明,所有樣品中均未擴(kuò)增到DNA-B組份,且未伴隨衛(wèi)星DNA分子。
　　 序列比較發(fā)現(xiàn),盡管TYLCV在世界范圍內(nèi)廣泛發(fā)生,但大多數(shù)分離物核苷酸序列相似性在93%以上,相較Begomovirus屬病毒其變異程度小。為了弄清楚其核苷酸序列保守的原因,為分析TYLCV的遺傳進(jìn)化軌跡及番茄抗TYLCV分子育種提供科學(xué)依據(jù),本研究以山東和陜西自然感染TYLCV的田間番茄為材料,從分子克隆出發(fā),對(duì)TYLCVDNA-A的種群結(jié)構(gòu)、

6、變異水平及堿基突變類型進(jìn)行了研究和分析。
　　 對(duì)TYLCV種群結(jié)構(gòu)的分析結(jié)果表明,TYLCV符合病毒準(zhǔn)種結(jié)構(gòu)的特性,即是由主序列和一系列十分相近但不完全一致的序列變異體共同組成的病毒群體。其種群突變克隆百分率及突變頻率均較低,分別為21.0%和2.36×10-4,其中2008年11月獲得的山東壽光分離物SD1DNA-A種群的變異水平與2011年11月獲得的陜西涇陽(yáng)分離物SX15相當(dāng),而2011年7月獲得的山東壽光分離物SD98

7、DNA-A種群的突變頻率則較低,為5.42×10-5,即同種地區(qū)不同時(shí)間及不同地區(qū)相同時(shí)間獲得TYLCV種群變異水平無(wú)明顯規(guī)律。
　　 對(duì)TYLCV種群內(nèi)堿基突變的分析表明,堿基突變?cè)贗R-AC1區(qū)內(nèi)均有分布,但主要集中在IR5'區(qū)及AC1非重疊區(qū)。種群內(nèi)堿基突變類型主要是堿基的替代突變,且C-T之間的堿基顛換為種群的主要堿基突變類型。陜西分離物SX15種群出現(xiàn)了突變積累的現(xiàn)象,實(shí)驗(yàn)中在AC1非重疊區(qū)的2152位以及在IR5'區(qū)

8、的37位和59位多次被檢測(cè)到相同類型的突變,是否這些位點(diǎn)突變的變異體具有選擇優(yōu)勢(shì)還需進(jìn)一步生物學(xué)驗(yàn)證。對(duì)TYLCV在AC1-AC4區(qū)發(fā)生的堿基突變及由此引起的氨基酸突變分析結(jié)果表明,AC1區(qū)上的堿基突變,無(wú)論是在重疊區(qū)還是在非重疊區(qū),均為非同義突變,而AC4區(qū),突變均為同義突變。
　　 對(duì)采自不同時(shí)間及地區(qū)的TYLCV種群序列分析表明,各分離物的主序列差異較大,其中SD1種群的主序列在SX15種群中以突變體的形式出現(xiàn),由此推測(cè),