表達(dá)dsRNA的轉(zhuǎn)基因家蠶對(duì)BmNPV的抗性研究.pdf

1、家蠶血液型膿病是由家蠶核型多角體病毒引起的一種傳染性病毒病，是養(yǎng)蠶業(yè)中危害最大的病害，至今尚無(wú)有劾的防治藥物，一旦發(fā)生往往會(huì)造成巨大的損失。利用RNAi對(duì)病毒基因的干擾作用，通過(guò)轉(zhuǎn)基因的方法賦予家蠶對(duì)BmNPV的抗性，是突破傳統(tǒng)育種方法，定向改造家蠶性狀的一種新途徑。要實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)，必需有二個(gè)基礎(chǔ)，一是外源基因高效導(dǎo)入及篩選的家蠶轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)，二是合適的能通過(guò)RNAi有效抑制病毒復(fù)制的靶基因。已有的研究表明利用RNAi技術(shù)通過(guò)干擾ie—1

2、、lef—1和gp64基因均可以有效抑制BmNPV的增殖，其中以ie—1作為RNAi的靶基因抑制BmNPV復(fù)制的效率最高，以gp64作為靶基因抑制BmNPV復(fù)制的效率最差。由于選擇干擾的靶基因不同，抑制病毒復(fù)制的效率相差甚遠(yuǎn)，即使對(duì)于同一基因，針對(duì)不同區(qū)域的siRNA其效率也有很大差異；盡管熒光蛋白報(bào)告基因方便了轉(zhuǎn)基因蠶篩選，但至今似乎仍沒(méi)有一個(gè)快速有效的理想方法。
　　 為了能通過(guò)RNAi和轉(zhuǎn)基因有機(jī)結(jié)合，提高家蠶對(duì)BmNPV

3、的抗性，本研究首先在體外，比較了不同siRNA在家蠶培養(yǎng)細(xì)胞中抑制病毒復(fù)制的效率，針對(duì)ie—1、lef—1基因不同區(qū)域，研究siRNA抑制BmNPV復(fù)制效果，結(jié)果顯示ie—siRNA對(duì)BmNPV抑制的效率要顯著高于lef—siRNA，其中以ie—1—97—siRNA(5'—GCCCAACGACUAUUUGAAUdTdT—3')效果最好；其次開(kāi)展了家蠶轉(zhuǎn)基因體系的優(yōu)化研究，結(jié)果顯示外源基因?qū)爰倚Q卵中的效率以先交后注的精子介導(dǎo)法為高，用G

4、418對(duì)轉(zhuǎn)基因蠶篩選的合適濃度和時(shí)機(jī)應(yīng)選擇在1眠前一天添食15mg/mL的G418一天，接著在2齡起蠶再用20mg/mL的G418篩選一天，從3齡開(kāi)始可以通過(guò)蠶的大小實(shí)現(xiàn)對(duì)轉(zhuǎn)基因蠶的初步篩選；第三將包含ie—97—siRNA對(duì)應(yīng)區(qū)域的ie—1dsRNA表達(dá)元件以及neo表達(dá)元件一起克隆進(jìn)piggyBac轉(zhuǎn)座子載體形成pigA3—IE—Neo的轉(zhuǎn)基因載體；第四將該載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞后獲得的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化紐胞對(duì)10—5滴度的BmNPV有一定的抗性，通過(guò)

5、精子介導(dǎo)法將轉(zhuǎn)基因載體導(dǎo)入家蠶卵、利用G418和綠色熒光雙重篩選獲得了轉(zhuǎn)基因家蠶，并通過(guò)PCR和點(diǎn)雜交對(duì)轉(zhuǎn)基因家蠶進(jìn)行了鑒定。最后通過(guò)人工感染BmNPV對(duì)G2、G3代轉(zhuǎn)基因家蠶的抗性進(jìn)行了鑒定，結(jié)果顯示不同系統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因家蠶對(duì)病毒的抗性存在顯著差異，轉(zhuǎn)基因蠶比正常蠶的平均死亡率均低10％左右，有些系統(tǒng)可以達(dá)到20％—60％，而在被感染的轉(zhuǎn)基因蠶中ie—1mRNA、lef—1mRNA相對(duì)水平較被感染的正常蠶分別低230和850倍左右。