大豆CDPK蛋白基因CDPK-SK5的分離、表達分析與亞細胞定位.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、CDPKs(鈣依賴蛋白激酶)是一類僅在植物和部分原生物中存在的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,在鈣離子介導的信號傳遞、植物生長發(fā)育以及植物響應生物和非生物脅迫中起重要作用,但大多數(shù)CDPKs的功能仍不是很清楚。由于大豆種子蛋白(約40%)和油脂(約20%)含量高,在種子發(fā)育成熟及貯藏過程中常會遇到高溫高濕等脅迫因子,從而導致種子劣變。本實驗室在鑒定出大豆種子田間劣變抗性不同品種的基礎上,對抗種子田間劣變和不抗種子田間劣變大豆種質(zhì)的差異蛋白質(zhì)組學

2、進行了研究,結果表明,不抗種子田間劣變的寧鎮(zhèn)1號大豆種子經(jīng)高溫高濕脅迫后CDPK-SK5蛋白(NCBI GenBank:LOC547885)呈上調(diào)表達趨勢。本研究在此基礎上對大豆的CDPK-SK5基因以及啟動子序列進行了分離和生物信息學分析;并對高溫高濕脅迫條件下CDPK-SK5基因的時空表達模式進行了研究;通過構建CDPK-SK5::GFP融合載體,對CDPK-SK5基因進行亞細胞定位研究;本研究的主要結果如下:
   1、以

3、寧鎮(zhèn)1號和湘豆3號大豆葉片為材料,分離鑒定出了大豆CDPK蛋白基因CDPK-SK5序列,并對其生物信息學特征進行了分析。同時,分離得到CDPK-SK5基因的啟動子序列,并通過PLACE和Promotor preditions軟件在線預測軟件對其序列進行了分析。CDPK-SK5基因的cDNA序列包含由1527個核苷酸組成的完整開放閱讀框(ORF),此ORF編碼508個氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì);該蛋白序列存在α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、延伸鏈和隨機卷

4、曲結構;多肽鏈表現(xiàn)為親水性,不存在跨膜結構域;含有多個潛在的Ser、Thr、Tyr磷酸化位點,可能定位于葉綠體中。通過植物啟動子順式調(diào)控元件預測軟件分析發(fā)現(xiàn)CDPK-SK5基因存在逆境脅迫響應元件2個TATA盒、1個銅離子應答元件(GTAC)、3個ABA應答元件的類似序列(ABRE-like)、1個MYC應答元件、5個W盒、1個MYB應答元件、1個乙烯應答元件(ERE)和3個CAAT盒;大豆種子特異性啟動子的順式作用元件包括1個RY r

5、epeat、1個SEF1 motif、1個SEF4 motif和9個E盒;光調(diào)節(jié)啟動子中存在的順式作用元件包括5個GT-1位點、2個I-盒和4個GATA-box。
   2、通過實時熒光定量PCR(qPCR)對CDPK-SK5基因在高溫高濕、低溫等非生物脅迫和器官特異性的表達模式進行了研究。研究發(fā)現(xiàn)CDPK-SK5經(jīng)高溫高濕和低溫脅迫處理后,種子田間劣變抗性不同的寧鎮(zhèn)1號和湘豆3號大豆種子中CDPK-SK5基因的表達存在差異,在

6、0h和168h兩者差異不顯著,24h至96h兩者差異顯著,均表現(xiàn)為種子田間劣變抗性品種湘豆3號的表達量顯著高于不抗品種寧鎮(zhèn)1號,在24h和96h差異達到極顯著水平。CDPK-SK5經(jīng)低溫脅迫處理后,隨低溫脅迫時間的延長,種子田間劣變抗性不同的寧鎮(zhèn)1號和湘豆3號大豆種子中CDPK-SK5基因的表達也存在差異。在7h和24h兩者表達量差異不顯著;在0h和19h,寧鎮(zhèn)1號的表達量極顯著高于湘豆3號的表達量;在14h,湘豆3號的表量極顯著高于寧

7、鎮(zhèn)1號的表達量。并且,CDPK-SK5基因在不同生長時期的表達也具有顯著差異。CDPK-SK5基因在營養(yǎng)生長時期和生殖生長時期均中呈先下調(diào)后上調(diào)表達的趨勢;營養(yǎng)生長時期,S期的表達量極顯著低于R期和L期;生殖生長時期,MS期的表達量極顯著高于F期至GS期的表達量,但F期至GS期的表達量差異不顯著。
   3、基因槍轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細胞的瞬時表達實驗結果表明,CDPK-SK5蛋白定位于細胞核和細胞膜。
   本研究的CDPK-

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