桉樹CAD、COMT基因的RNAi載體構建及煙草轉化研究.pdf

1、桉樹是我國南方主要造紙樹種，但在制漿造紙過程中，桉樹木材的木質素去除需消耗大量化學品，并帶來嚴重環(huán)境污染。因而，通過轉基因技術培育低木質素桉樹造紙樹種，可從源頭上降低木質素含量、減少化學品消耗和降低污染，具有重大的經濟效益、社會效益和生態(tài)效益。本文以桉樹木質素合成調控的2個關鍵基因：肉桂醇脫氫酶(CAD)和咖啡酸—O—甲基轉移酶(COMT)為對象，采用RNA干擾技術，分別構建了桉樹CAD、COMT基因的RNA干擾載體pRi—Ec—CAD

2、和pRi—Ec—COMT，并通過煙草轉基因實現功能驗證，為低木質素桉樹轉基因育種研究提供理論依據和物質基礎。
　　 獲得了以下主要結果：
　　 (1)桉樹CAD及COMT基因的RNA干擾片段的獲得。在已克隆的桉樹CAD、COMT全長cDNA序列的基礎上，設計特異引物，通過高保真擴增技術克隆了桉樹CAD及COMT的正義、反義基因干擾片段，大小分別為：CAD550bp，COMT616bp。
　　 (2)桉樹CAD及C

3、OMT基因的RNA干擾載體構建。采用現代分子生物學手段，以pRi35s與pCAMBIA2301作為橋梁載體，分別成功構建了含有CaMV35S啟動子、過氧化氫酶內含子(catalase intron)及具有抗生素(Kan)選擇標記基因的CAD及COMT基因的RNAi載體：pRi—Ec—CAD和pRi—Ec—COMT，并通過凍融法將其成功導入農桿菌LBA4404中。
　　 (3)桉樹CAD及COMT基因的RNA干擾載體的煙草轉基因。

4、通過農桿菌介導的葉盤法轉化技術，將RNAi載體pRi—Ec—CAD和pRi—Ec—COMT分別轉入到模式植物煙草中，并獲得了經抗Kan篩選的RNAi片段的候選轉基因植株，對候選植株的基因組DNA進行卡那霉素基因擴增檢測，篩選出桉樹CAD及COMT基因RNA干擾載體導入的陽性轉基因煙草植株。
　　 (4)桉樹CAD基因的RNA干擾效果分析。對不同時期生長的轉桉樹CAD基因干擾片段的煙草植株進行表型觀察，與野生型煙草植株相比，轉基因

5、煙草植株的形態(tài)和生長發(fā)育未見異常；對培養(yǎng)了6個月的轉基因植株進行Klason木質素分析，與野生型煙草植株相比，轉基因煙草植株木質素含量降低了12．3％～14．5％，表明桉樹CAD基因的RNA干擾載體在不影響煙草植株正常生長發(fā)育情況下，能有效降低煙草植株的木質素含量。
　　 (5)桉樹COMT基因的RNA干擾效果分析。對不同時期生長的轉桉樹COMT基因干擾片段的煙草植株進行表型觀察，與野生型煙草植株相比，轉基因煙草植株在整個生長時

6、期都表現出較大差異，葉片較大，植株矮小，莖段柔軟細小，易倒伏，生長緩慢且成活率低；對培養(yǎng)了6個月的轉基因煙草植株進行Klason木質素分析，與野生型煙草植株相比，轉基因煙草植株木質素含量分別降低2．4％～3．0％，結果表明，桉樹COMT基因的RNA干擾載體對煙草的木質素下調效果不明顯，同時還影響轉基因煙草植株的正常生長發(fā)育。
　　 上述轉基因煙草植株表型變化及抑制木質素合成能力的結果初步表明，本文所構建的桉樹CAD基因RNA干擾