果實酸性轉(zhuǎn)化酶研究—蘋果果實酸性轉(zhuǎn)化酶的純化及抗體制備;—脫落酸對蘋果、葡萄果實酸性轉(zhuǎn)化酶的調(diào)節(jié).pdf

1、酸性轉(zhuǎn)化酶(β-fructosidase;EC3.2.1.26)包括了定位于液泡的可溶性酸性轉(zhuǎn)化酶(SAI)和定位于胞外空間的細(xì)胞壁結(jié)合酸性轉(zhuǎn)化酶(CWI),它們在經(jīng)濟(jì)庫細(xì)胞中蔗糖的代謝貯藏和作物庫強(qiáng)調(diào)節(jié)中起著十分關(guān)鍵的作用,因此探討果實發(fā)育過程酸性轉(zhuǎn)化酶的調(diào)節(jié)機(jī)制是闡明果實品質(zhì)形成理論的一個重要方面.該文首先從蘋果果實中純化了SAI和CWI,并制備了抗體,在此基礎(chǔ)上,首次探討了促進(jìn)果實碳水化合物積累的重要激素—脫落酸(ABA)對蘋果和

2、葡萄果實酸性轉(zhuǎn)化酶調(diào)節(jié)的酶學(xué)機(jī)制,為進(jìn)一步弄清果實發(fā)育過程中酸性轉(zhuǎn)化酶活性調(diào)節(jié)的分子機(jī)制及其生物學(xué)意義奠定了良好的實驗和理論基礎(chǔ).依次通過(NH<,4>)<,2>SO<,4>沉淀、離子交換層析、凝膠過濾和親和層析等步驟從蘋果果實中分別獲得了電泳純的可溶性酸性轉(zhuǎn)化酶和細(xì)胞壁酸性轉(zhuǎn)化酶蛋白,其亞基分子量約為50kD,全酶分子量均為220kD;這兩種酸性轉(zhuǎn)化酶有著相似的酶學(xué)特性,但它們在某些方面與其它植物的酸性轉(zhuǎn)化酶有所不同,如對棉子糖的Km

3、極高,對水蘇糖沒有水解活性,果糖對酶活性的抑制方式為混合型抑制;在蘋果果實中未發(fā)現(xiàn)有酸性轉(zhuǎn)化酶的蛋白抑制因子.分別將這兩種酸性轉(zhuǎn)化酶的抗血清通過(NH<,4>)<,2>SO<,4>分級沉淀、DEAE-Sepharose層析和POD-Sepharose層析純化,根據(jù)Western blotting、免疫抑制分析、酶聯(lián)免疫分析和Protein dot blot,表明所制得的這兩種抗體對蘋果果實酸性轉(zhuǎn)化酶有良好的特異性和較高的檢測靈敏度;利用

4、這些抗體在蘋果的葉、花和果實的粗提液中均檢測到三條多肽,分子量分別為50kD、68kD和30kD,后兩條可能在純化過程中丟失了,蘋果中的這兩種酸性轉(zhuǎn)化酶可能各存在三種亞型.通過應(yīng)用ABA注射連體的蘋果(Malus Domestica Borkh cv.Starkrimson)果實和溫育果實圓片,研究證明:ABA可明顯地激活果實可溶性酸性轉(zhuǎn)化酶和細(xì)胞壁酸性轉(zhuǎn)化酶,且這種激活作用具有溫育時間、ABA劑量、介質(zhì)pH、活體組織以及發(fā)育階段的依賴

5、性,ABA最大的激活效應(yīng)在pH5.5介質(zhì)中和盛花后100d的果實;20μmol/LABA溫育40min即可觀察到果實圓片酸性轉(zhuǎn)化酶活性的增加.酶聯(lián)免疫法定量測定和Western blotting分析均表明:ABA對酸性轉(zhuǎn)化酶的這種激活作用不是通過促進(jìn)酶蛋白的合成來實現(xiàn)的,而可能是一種翻譯后的調(diào)節(jié)機(jī)制;根據(jù)這些結(jié)果,我們認(rèn)為以往的研究中所觀測到的ABA對經(jīng)濟(jì)庫器官庫強(qiáng)的增強(qiáng)效應(yīng)可能與ABA誘導(dǎo)酸性轉(zhuǎn)化酶的激活有關(guān).應(yīng)用外源ABA預(yù)溫育葡萄

6、(V.vinifera.L.×V.lubrusca L.cv.Kyoho)果實圓片和滲透完整果實的實驗體系,證實了ABA在果實發(fā)育的各個時期都促進(jìn)了可溶性酸性轉(zhuǎn)化酶和細(xì)胞壁酸性轉(zhuǎn)化酶活性;并應(yīng)用Western blotting和酶聯(lián)免疫分析,證明了ABA對酸性轉(zhuǎn)化酶活性的促進(jìn)作用是通過增加其基因表達(dá)量來實現(xiàn)的;ABA的這種激活效應(yīng)具有介質(zhì)pH、溫育時間、ABA劑量和活體組織的依賴性;蛋白質(zhì)合成抑制劑環(huán)己亞胺和mRNA轉(zhuǎn)錄抑制劑放線菌素D