喹賽多對C2C12肌管基因與蛋白表達的影響研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、喹賽多作為新型喹噁啉類抗菌促生長飼料添加藥物,與同類藥物相比,具有更高的安全性。喹賽多對多種家畜家禽及水產(chǎn)動物均有較好的促生長作用。本實驗室前期研究表明,喹賽多可提高豬體內循環(huán)GH和IGF-1的含量,能夠誘導豬肝細胞IGF-1的表達量上調。GH和IGF-1位于動物激素生長軸中,可直接或間接的作用于肌肉組織,使動物整體表現(xiàn)出生長。那么喹賽多是否也能夠直接調控直觀體現(xiàn)動物生長的肌肉組織呢?探明喹賽多對肌肉組織有無直接作用,若有作用又是通過何

2、種機制發(fā)揮作用,這為進一步探討喹賽多促生長機制提供了理論依據(jù)和新思路。本研究以小鼠成肌細胞C2C12細胞系分化所形成的肌管為研究模型,首先選取了喹賽多作用細胞的最佳濃度和時間,然后通過基因芯片技術和雙向電泳與質譜聯(lián)用技術篩選出了喹賽多影響下差異表達的基因和蛋白質,并對喹賽多影響肌肉細胞的機制進行了初步探討。
  1.喹賽多作用于C2C12肌管的最佳濃度與時間的選取
  本研究設置了喹賽多作用濃度梯度(1,2,4,8,12μM

3、),通過BCA蛋白定量法分別測定了喹賽多作用C2C12肌管4h,8h,12h后的細胞總蛋白濃度。結果表明,2μM喹賽多處理細胞4h時細胞總蛋白含量相對空白對照組上調20%,統(tǒng)計學分析表明,差異極顯著。這說明2μM、4h的藥物作用濃度與時間為最佳組合,故以此條件進行差異表達蛋白的篩選。
  由于基因表達模式與蛋白質表達模式的時空關系不同,本研究又選取了基因指標來篩選喹賽多對細胞基因mRNA水平表達影響最為合適的作用濃度和時間。結合蛋

4、白質定量結果,在五個梯度濃度中,8μM和12μM濃度喹賽多對C2C12細胞無促進作用,而細胞對1μM和4μM的藥物作用濃度并不敏感,所以本研究直接采用2μM的藥物濃度作用細胞,通過RT-qPCR技術,分別測定1h,2h,4h,6h時細胞內MyHC的mRNA表達量。結果表明4h時MyHC表達量最高,是空白組的2.4倍。故以此條件進行基因芯片分析,以實現(xiàn)對差異基因的檢測。
  2.喹賽多作用C2C12肌管后差異表達的基因
  以

5、2μM濃度的喹賽多孵育細胞4h,用基因芯片檢測此時細胞基因組中相對于空白對照組mRNA表達量發(fā)生變化的基因。本研究共篩選出68個已知基因,其中32個基因上調表達,36個基因下調表達。對這些基因進行分析,按分子功能可將這些基因分為5類:結構組分、結合活性、酶活性、受體活性、轉錄活性;按生物進程可分為7類:蛋白質修飾、代謝、生物合成、調控、轉錄、應激、細胞生長。對C2C12肌管的生長相關基因進行分析,本研究推斷,喹賽多影響肌肉細胞生長的可能

6、機制為:一方面誘導細胞內Tceal7基因表達量上調,引發(fā)細胞進一步融合;一方面通過影響細胞內蛋白質磷酸化水平調節(jié)細胞內信號通路實現(xiàn)其促生長作用。此外,喹賽多還可增強細胞內mRNA轉錄調控活動,影響代謝相關基因差異表達,為細胞提供物質與能量。用RT-qPCR驗證部分差異基因表達,各基因mRNA表達量變化趨勢與芯片結果一致,證實本研究所得結果可靠。
  3.喹賽多作用C2C12肌管后差異表達的蛋白
  2μM濃度的喹賽多作用細胞

7、4h后,經(jīng)二維凝膠電泳和飛行時間質譜聯(lián)用,檢測發(fā)現(xiàn),喹賽多處理組與空白對照組相比,有20個差異表達的蛋白鑒定成功,其中有18個表達量上調,2個下調表達。對這些蛋白的功能進行分析,差異蛋白在分子功能方面主要具備結合活性和酶活性,對其所參與的生物進程進行歸類:物質與能量代謝、生物合成、細胞分化、信號轉導、氧化應激。烯醇化酶Eno1在喹賽多作用下的C2C12肌管中上調表達,細胞內骨架相關蛋白和肌肉分化相關蛋白均出現(xiàn)上調,預示喹賽多可能促發(fā)C2

8、C12肌管重塑,進一步融合形成更為粗大的肌纖維。
  在喹賽多作用下,細胞內超氧化物歧化酶Sod1和過氧化物酶Prdx1含量增加,多種氧化應激相關蛋白上調表達,通過激活細胞內信號通路轉導來應對氧化物刺激產(chǎn)生的不良影響。Sod1可將細胞內的自由基轉化為H2O2,Prdx1可進一步清除H2O2,使細胞免受損傷。這提示喹賽多在代謝過程中可能產(chǎn)生了自由基,進而形成H2O2。研究表明,低濃度的H2O2對骨骼肌細胞內的PI3K/Akt及其它促

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