甘藍(lán)型油菜-野芥二體異附加系BAC文庫(kù)的構(gòu)建及野芥BAC克隆的篩選.pdf

1、模式植物基因組學(xué)研究已進(jìn)入后基因組學(xué)時(shí)代，即功能基因組學(xué)時(shí)代。在我國(guó)盡管水稻基因組全序列測(cè)序已經(jīng)完成，但總體上非模式植物的研究仍然處于由結(jié)構(gòu)基因組學(xué)向功能基因組學(xué)過(guò)度階段，在一段時(shí)間內(nèi)我國(guó)基因組學(xué)的研究仍將停留在起步階段，如BAC文庫(kù)的構(gòu)建及基于BAC的物理作圖等方面的研究。油菜是世界上和我國(guó)最重要的油料作物之一，由于其基因組較大，致使其基因組學(xué)的研究滯后于擬南芥等模式植物的研究。本研究利用甘藍(lán)型油菜.野芥二體異附加系(中國(guó)農(nóng)科院油料所

2、胡瓊老師已申請(qǐng)專(zhuān)利)為材料，構(gòu)建其BAC文庫(kù)，為開(kāi)展油菜基因組學(xué)的研究奠定一定的技術(shù)平臺(tái)。 構(gòu)建大片段DNA文庫(kù)的關(guān)鍵技術(shù)包括載體和大片段DNA的制備兩個(gè)方面。大量轉(zhuǎn)化后，得到了69120個(gè)克隆，這些克隆以單菌落的方式保存于180塊384孔板中，組成單克隆文庫(kù)。本文庫(kù)插入片段平均為110 kb，以甘藍(lán)型油菜單倍體基因組120.Mb計(jì)算，該文庫(kù)共覆蓋了6.336倍以上的基因組，篩選到任一基因的可能性大99.82％，另外分別用葉綠體

3、基因psbA及線粒體基因atp6為探針，通過(guò)菌落雜交檢測(cè)，沒(méi)有細(xì)胞器DNA的污染。 基于Southern技術(shù)的菌落原位雜交是分子生物學(xué)的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)方法。以打碎的野芥(新疆野生油菜18號(hào))基因組作為探針，分別在無(wú)外源基因組做封阻和500倍中雙四號(hào)基因組做封阻的條件下，對(duì)野芥和中雙四號(hào)BAC克隆進(jìn)行雜交，結(jié)果顯示，在無(wú)外源基因組做封阻時(shí)，野芥克隆均有陽(yáng)性信號(hào)，這些信號(hào)中的一部分在500倍中雙四號(hào)基因組封阻時(shí)消失，說(shuō)明兩種基因組間有一定

4、的同源序列；此外，野芥和中雙四號(hào)部分克隆都出現(xiàn)的強(qiáng)烈陽(yáng)性信號(hào)，并且這些信號(hào)的強(qiáng)度基本不受封阻影響。因此，用野芥基因組作探針時(shí)，雖能獲得陽(yáng)性信號(hào)，但這些信號(hào)是非特異的，無(wú)法為后期篩選野芥BAC克隆提供可靠的依據(jù)。 核酸的復(fù)性動(dòng)力學(xué)研究表明，在真核生物的基因組中存在著大量不同拷貝數(shù)的重復(fù)序列，其中有些是一個(gè)種或一個(gè)基因組所特有的。以野芥的種特異性重復(fù)序列為探針，對(duì)二體異附加系BAC文庫(kù)進(jìn)行篩選，就可以得到野芥來(lái)源的克隆，為下一步獲得