基于懸浮細胞培養(yǎng)的大麥耐鎘性基因型差異及大小麥耐滲透脅迫差異的機理研究.pdf

1、鎘(Cadmium，Cd)是毒性最強的重金屬污染元素之一。Cd在環(huán)境中的遷移性強，極易被植物吸收積累，超過一定限度不僅嚴重影響作物生長發(fā)育，降低其產量和品質，而且能通過食物鏈富集，危害人體健康。因此，研究Cd的植物毒性機制，以及植物對Cd脅迫的應答機制，對于提高植物對Cd的抗/耐性，改良糧食作物品質，降低Cd從植物進入食物鏈的危險性，具有十分重要的理論和實踐指導意義。 目前，Cd脅迫對植物生理生化影響的研究大多集中在植株水平上進

2、行，而細胞生理生化對Cd脅迫是如何反應這一研究領域的探索卻相對較少。懸浮細胞具備很好的均一性，并且對環(huán)境脅迫的反應更為敏感和直接。 為此，本研究以耐Cd性不同的大麥基因型(萎縮不知，耐Cd基因型；東17，Cd敏感基因型)為材料，在成功建立分散均勻、穩(wěn)定的胚性懸浮細胞系的基礎上，較為系統(tǒng)地研究了Cd脅迫對大麥細胞抗氧化系統(tǒng)的影響及其基因型差異；并進一步探討了飼喂Zn、Fe、GSH和SA對大麥細胞Cd毒害的緩解效應與基因型差異及其生

3、理生化機制。此外，我們還培育了大麥(PC1163)和小麥(PC998)懸浮細胞系，并采用24孔板培養(yǎng)方法，研究了鹽(NaCl處理)和干旱(PEG處理)脅迫對細胞生長和滲透調節(jié)物質脯氨酸含量的影響，并從基因表達水平探討了大小麥耐滲透脅迫差異的機理。主要研究結果如下： 1.以直徑約2mm的幼胚為外植體，建立了萎縮不知和東17兩個大麥基因型的穩(wěn)定均質的懸浮細胞系，初步研究了大麥懸浮細胞的生長特性，探討了不同水平Cd脅迫對細胞活力的影響

4、及基因型差異。結果表明，大麥懸浮細胞的生長可以明顯分為3個階段：遲滯期(0-3d)、指數(shù)生長期(4-8d)、靜止期(9-12d)，由此進一步確定了大麥細胞的最佳繼代周期為7-8d。大麥懸浮培養(yǎng)液pH值的變化與細胞的生長階段存在一定的相關性，pH值變化的基本趨勢是先迅速下降，再緩慢上升，最后稍有下降。隨著Cd處理時間的延長和濃度的加大，大麥細胞活力逐步下降，通過細胞活力及MDA含量兩項指標的測定比較，我們確定了Cd脅迫濃度50μM，處理時

5、間5d，作為后繼生理生化研究的試驗處理條件。 2.研究了不同濃度Zn、Fe對Cd脅迫下大麥細胞活力和抗氧化酶活性的影響及基因型差異。結果表明，Cd脅迫會導致大麥細胞活力下降、MDA含量上升，敏感基因型東17細胞較耐性基因型萎縮不知細胞受害嚴重。50μMCd脅迫下，耐性細胞系萎縮不知的SOD、POD活性顯著增強，但CAT活性受到抑制。敏感細胞系東17的SOD、CAT活性在Cd處理ld后有所上升，但處理5d后，活性顯著下降；而POD

6、活性在整個處理時期內均顯著高于對照。缺Zn處理和缺Fe處理顯著降低了Cd脅迫下大麥細胞活力，并導致MDA含量劇烈升高；同時也使得SOD、POD、CAT活性急劇下降。而300μMZn和500μMFe在一定程度上緩解了Cd脅迫對大麥細胞造成的氧化損傷，誘導大麥細胞抗氧化酶活性(SOD、POD、CAT)較單獨Cd處理上升，同時MDA含量有所下降。 3.探討了外源GSH和SA對Cd脅迫下大麥細胞抗氧化系統(tǒng)的影響及基因型差異。結果表明，5

7、0μMCd脅迫誘導耐性基因型萎縮不知大麥細胞APX、MDHAR活性顯著提高，在處理中后期GR、DHAR活性也顯著上升；而敏感基因型東17在50μMCd脅迫下僅MDHAR活性顯著增強，至處理中后期盡管GR活性有所上升，但APX活性顯著下降，且DHAR活性在整個處理時期內均受到抑制。盡管50μMCd脅迫降低了兩基因型大麥懸浮細胞GSH、AsA含量，并且細胞內GSH/GSSG、AsA/DHA比值亦較對照有所下降，但耐性較強的萎縮不知胞內的GS

8、H、AsA含量及GSH/GSSG、AsA/DHA水平較東17高。外源GSH和SA降低了Cd脅迫對大麥細胞造成的氧化傷害，使得大麥細胞MDA含量較單獨Cd處理有所下降，而細胞活力稍有上升。外源GSH顯著提高了Cd脅迫下兩基因型大麥細胞APX、MDHAR活性及內源GSH含量和GSH/GSSG比率；而外源添加SA顯著提高了兩個大麥細胞系GSH含量和GSH/GSSG比率，同時對萎縮不知大麥細胞SOD等抗氧化保護酶、AsA-GSH循環(huán)關鍵酶類以及

9、AsA、AsA/DHA比率也有一定的促進作用。 4.以大麥(PC1163)和小麥(PC998)懸浮細胞系為試驗材料，采用24孔板培養(yǎng)方法，探討了鹽和干旱脅迫對細胞生長和滲透調節(jié)物質脯氨酸含量的影響，并進一步從基因表達水平探討了大小麥耐滲透脅迫差異的機理。結果表明，大麥(PC1163)和小麥(PC998)細胞對滲透脅迫的耐性存在差異，其中大麥懸浮細胞對滲透脅迫的耐性較強。100mMNaCl處理24h后，小麥(PC998)懸浮細胞系

10、中的活細胞量顯著下降，而大麥細胞則無顯著變化。脯氨酸是禾本科植物細胞中重要的滲透調節(jié)劑之一，大小麥細胞中脯氨酸含量的分析結果顯示，小麥(PC998)細胞中的脯氨酸水平為大麥(PC1163)細胞的3倍。NaCl脅迫下，兩種類型細胞的脯氨酸含量均隨處理時間的增加而升高；而PEG處理后，細胞內脯氨酸水平的增幅較小。 本試驗以Tubulin為內參，通過半定量RT-PCR檢測分析了滲透脅迫下脯氨酸生物合成關鍵基因(P5CS和P5CR)在轉

11、錄水平上的變化。NaCl和PEG處理下，小麥(PC998)細胞P5CS和P5CR的轉錄水平隨脅迫時間的變化趨勢與其游離脯氨酸含量測定值的變化較為一致；但在大麥(PC1163)細胞中并未得到相同的結果，NaCl和PEG處理下，大麥(PC1163)細胞中P5CS和P5CR的轉錄水平無顯著變化，但其脯氨酸含量卻隨處理時間的延長而上升。進一步分析結果發(fā)現(xiàn)，大麥(PC1163)細胞中P5CS和P5CR的轉錄水平較小麥(PC998)高，而大麥(PC