雞Mx蛋白基因多態(tài)性檢測及其細胞定位的研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、Mx基因是Lindenmann在研究A2G小鼠抗流感病毒試驗時發(fā)現(xiàn)的,因能抵抗粘液病毒而命名為Mx(myxovirus resistant)基因。關于禽類Mx蛋白的研究,1992年首次發(fā)現(xiàn)了鴨的Mx蛋白后,雞的Mx蛋白基因也被克隆,雞的Mx蛋白的抗病毒活性受2032位點單核苷酸引發(fā)631位氨基酸改變的影響,當631位氨基酸為天冬酰胺時有抗病毒活性,為絲氨酸時則無抗病毒活性。本研究通過PCR-RFLP對我國不同品種雞Mx基因2032位點單

2、核苷酸多態(tài)性進行檢測;構建EGFP-Mx融合表達載體,轉染NIH-3T3細胞觀察Mx蛋白的細胞亞定位,同時進行體外抗VSV病毒試驗。旨在探索Mx蛋白的細胞分布情況及其抗病毒活性。主要研究結果如下: 1.研究采用錯配PCR-RFLP的方法對15個品種雞的Mx基因進行篩查,旨在探索不同雞品種Mx基因第2032位點抗病基因(A)與易感等位基因(G)的多態(tài)性,為生產轉基因雞的可行性提供理論基礎。研究結果顯示,15個雞品種Mx基因的203

3、2位點存在2個等位基因(A、G),3種基因型(AA、AG、GG),其中鹿苑雞、狼山雞、斗雞未發(fā)現(xiàn)AA型個體,茶花雞、紅色原雞未發(fā)現(xiàn)GG個體;攜帶Mx抗性基因(A)和易感基因(G)的比例分別是0.350,0.650;抗性等位基因A的檢測比例為0.034~0.984。紅色原雞的抗性等位基因A基因頻率(0.984)顯著高于地方雞種的抗性等位基因A的基因頻率(0.321);地方雞種中的觀賞型、蛋肉兼用型、肉用型、蛋用型雞種的抗性等位基因A的基因

4、頻率分別為0.221、0.297、0.425、0.462。X2適合性檢驗表明15個品種的雞群均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)。 2.設計引物去掉報告基因EGFP的終止密碼子,兩端加上酶切位點(EcoR V、Xba I),用高保真酶擴增出EGFP基因。將該PCR產物與T載體連接,酶切測序鑒定正確后,雙酶切連接產物獲得EGFP基因,將其插入真核表達載體pcDNA3.0-MMx中,構建重組表達載體EGFP-Mx,經PCR、酶

5、切鑒定驗證構建正確后,提取并純化。采用電穿孔法轉染NIH-3T3細胞,轉染后48 h用熒光倒置顯微鏡觀察,同時RT-PCR鑒定其表達。結果顯示了構建了EGFP-Mx融合表達載體,轉染到NIH-3T3細胞后48 h通過熒光倒置顯微鏡可以明顯看出綠色熒光分布于細胞質中。 3.為了驗證雞Mx蛋白的抗病毒能力,用VSV病毒株攻擊細胞的進行抗病毒效應試驗。VSV抗性試驗表明:在0.01TCID50 VSV對細胞感染48 h后,正常NIH-

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