Vill轉(zhuǎn)基因小鼠的制備.pdf

1、VILL全稱(chēng)為VILLIN-like，絨毛蛋白樣蛋白，是VILLIN蛋白超家族的成員之一。VILLIN是一種多能的肌動(dòng)蛋白調(diào)節(jié)蛋白，能夠依賴(lài)Ca2+成核、結(jié)合、帽化、切割上皮細(xì)胞中的肌動(dòng)蛋白。在磷酸化后，通過(guò)與PIP2、PLC-γ1、Jak3相互作用來(lái)影響細(xì)胞形態(tài)和遷移等；在腫瘤癌癥和抗細(xì)胞凋亡的方面有著重要的作用。VILL與VILLIN具有極為相似蛋白結(jié)構(gòu)，同樣具有6個(gè)重復(fù)的gelsolin-like結(jié)構(gòu)域和一個(gè)headpiece(H

2、P)結(jié)構(gòu)，這預(yù)示兩者具有相似的功能，但有關(guān)VILL的報(bào)道極少。與此同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)化學(xué)誘變獲得一種呈隱性遺傳的稀毛小鼠，定位鑒定為9號(hào)染色體上Vill和Plcd1兩個(gè)基因的缺失，為驗(yàn)證(或排除)Vill基因與稀毛表型的關(guān)系，計(jì)劃導(dǎo)入外源Vill基因來(lái)拯救突變小鼠“被毛稀疏”的表型，本文首先開(kāi)展了Vill轉(zhuǎn)基因小鼠工作。
　　 第一部分pEF6V5His-Vill表達(dá)載體的構(gòu)建。
　　 構(gòu)建表達(dá)Vill的表達(dá)載體是制作V

3、ill轉(zhuǎn)基因小鼠的首要工作。首先從C57BL/6小鼠腎臟中提取小鼠總RNA，通過(guò)RT-PCR方法擴(kuò)增出Vill完整的編碼區(qū)序列。將PCR產(chǎn)物與pMD19-T Vector連接，轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌，經(jīng)藍(lán)白斑篩選、PCR檢測(cè)及測(cè)序鑒定陽(yáng)性的單克隆質(zhì)粒。通過(guò)引物引入SpeI和BstBI酶切位點(diǎn)，以及對(duì)終止密碼子進(jìn)行修改，再以pMD19-T-Vill為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將含目的基因PCR產(chǎn)物和pEF6V5His表達(dá)載體同時(shí)進(jìn)行SpeI和Bs

4、tBI的雙酶切、連接、轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌，經(jīng)氨芐青霉素篩選、酶切、PCR檢測(cè)和測(cè)序鑒定重組的pEF6V5His-Vill。通過(guò)電轉(zhuǎn)染的方法將表達(dá)質(zhì)粒pEF6V5His-Vill導(dǎo)入L929小鼠成纖維細(xì)胞中，使用抗His鼠單克隆抗體作為一抗，Cy3紅色熒光標(biāo)記的山羊抗鼠IgGH+L單克隆抗體作為二抗，經(jīng)間接免疫熒光法檢測(cè)pEF6/V5-His-Vill重組質(zhì)粒在細(xì)胞中的表達(dá)情況。結(jié)果，我們通過(guò)RT-PCR法成功擴(kuò)增出2605bp的Vil

5、l目的基因片段，構(gòu)建了pMD19-T-Vill克隆載體，經(jīng)進(jìn)一步亞克隆，成功獲得pEF6V5His-Vill重組表達(dá)載體。經(jīng)體外轉(zhuǎn)染細(xì)胞水平表達(dá)檢測(cè)，電轉(zhuǎn)染條件為80V35ms，在綠色熒光的激發(fā)下檢測(cè)到L929細(xì)胞的胞質(zhì)胞膜有明顯的紅色熒光。pEF6V5His-Vill重組表達(dá)載體在L929細(xì)胞中的成功表達(dá)，為下一步顯微注射制備Vill轉(zhuǎn)基因小鼠打下基礎(chǔ)。
　　 第二部分顯微注射法獲得Vill轉(zhuǎn)基因小鼠。
　　 在成功獲

6、得pEF6V5His-Vill重組表達(dá)載體的基礎(chǔ)上，將提取的表達(dá)質(zhì)粒pEF6V5His-Vill用內(nèi)切酶AseI和NruI進(jìn)行雙酶切，經(jīng)Whatman方法純化，獲得顯微注射用DNA片段。從超排處理的4周齡B6CF1雌鼠輸卵管中收集用于顯微注射0.5天的受精卵。顯微注射外源DNA后，經(jīng)短暫體外培養(yǎng)，選擇存活的胚胎過(guò)夜培養(yǎng)。移植進(jìn)入當(dāng)天見(jiàn)栓8周齡的ICR假孕受體小鼠輸卵管，常規(guī)飼育。對(duì)出生的小鼠進(jìn)行PCR檢測(cè)，初步篩選陽(yáng)性小鼠，計(jì)算整合效率

7、，并觀察小鼠的外觀表型。結(jié)果，酶切純化獲得用于顯微注射的DNA片段，該片段含有含hEF-1α啟動(dòng)子、Vill目的基因片段、V5、His-tag和BGH，將3ng/μl的轉(zhuǎn)基因構(gòu)件顯微注射到390枚受精卵雄原核中，經(jīng)短暫體外培養(yǎng)存活155枚，存活率為39.74％，最終11只受體小鼠一共出生77只小鼠，使用兩種引物對(duì)這些小鼠的基因組DNA進(jìn)行PCR檢測(cè)，初步證實(shí)其中的17只小鼠為強(qiáng)陽(yáng)性，2只為弱陽(yáng)性，整合率為24.68％。且外觀上陽(yáng)性小鼠和