蜱鐵蛋白和抗菌多肽cDNA的克隆和分析.pdf

1、1、微小牛蜱鐵蛋白cDNA的克隆和分析從微小牛蜱克隆到一個新的鐵蛋白編碼基因,cDNA全長642bp,編碼區(qū)為123-639 nt,編碼172個氨基酸殘基,該蛋白預測的分子量為19.9kDa,等電點為4.24.預測氨基酸序列與已報道的變異革蜱、毛白鈍緣蜱和蓖子硬蜱鐵蛋白同源性分別為93.60％、88.37％和83.72％.該核苷酸序列在mRNA 5′-未翻譯區(qū)的莖環(huán)結構存在鐵應答元件,其氨基酸序列上帶有典型的亞鐵氧化酶中心結構的保守序列

2、.經(jīng)RT-PCR分析表明,該基因在微小牛蜱卵、幼蜱、半飽血雌蜱、飽血雌蜱和雄蜱這幾個階段均有表達.將該基因亞克隆到pET-28a(+)表達載體,轉化BL21(DE3)宿主菌,經(jīng)IPTG誘導,可成功表達.重組融合蛋白大小為25kDa左右,與預期大小一致.Western印跡分析表明,抗微小牛蜱唾液抗體不能識別重組表達蛋白.2、鐮形扇頭蜱鐵蛋白cDNA的克隆和表達從鐮形扇頭蜱克隆到一個新的鐵蛋白編碼基因,cDNA全長642bp,編碼區(qū)為123

3、-639 nt,編碼172個氨基酸殘基,該蛋白預測的分子量為19.9kDa,等電點為4.90.預測氨基酸序列與已報道的亞洲璃眼蜱、變異革蜱、斑點鈍眼蜱和微小牛蜱同源性較高,分別達到98.26％、97.09％、96.51％和95.93％.該核苷酸序列在mRNA 5′-未翻譯區(qū)的莖環(huán)結構存在鐵應答元件,其氨基酸序列上帶有典型的亞鐵氧化酶中心結構的保守序列.經(jīng)RT-PCR分析表明,該基因在卵、幼蜱、飽血幼蜱、飽血若蜱、未飽血成蜱、飽血成蜱唾液

4、腺和飽血成蜱殼幾個階段和蜱的唾液腺、殼中均有表達.將該基因亞克隆到pET-28a(+)表達載體,轉化BL21(DE3)宿主菌,經(jīng)IPTG誘導,可成功表達.重組融合蛋白大小為25kDa左右,與預期大小一致.3、微小牛蜱一個抗菌多肽cDNA的克隆和分析為了研究蜱與病原相互作用機制,控制蜱及蜱傳疾病,本研究根據(jù)微小牛蜱巴西株近期報道的一種結構特殊的抗菌多肽核苷酸序列,從微小牛蜱中國安徽株克隆到一抗菌多肽基因,全長383 bp,編碼110個氨基

5、酸殘基,該蛋白預測的分子量為12.2 kDa,等電點為4.87.經(jīng)同源性比較,該微小牛蜱巴西株抗菌多肽基因有100％的相同性.經(jīng)RT-PCR分析表明,該基因在微小牛蜱卵、幼蜱、半飽血雌蜱、飽血雌蜱和雄蜱這幾個階段均有表達.將該基因亞克隆到pET-28a(+)表達載體,轉化BL21(DE3)宿主菌,經(jīng)IPTG誘導,可成功表達.重組融合蛋白大小為15 kDa左右,與預期大小一致.體外抗菌試驗表明,重組蛋白抗菌活性不明顯.Western印跡分