大豆尖鐮孢菌的快速分子檢測與遺傳多樣性分析及品種抗性研究.pdf

1、大豆(Glycine max)是重要的經濟作物，在農業(yè)生產中占有重要地位。近年來，由尖鐮孢菌引起的大豆枯萎病范圍逐漸擴大，危害日益突出。該病害是一種土傳病害，病菌生活力極強，可在土壤中生存多年。國內外大量研究和生產實踐證明，選育和利用抗病品種是防治大豆枯萎病最經濟有效的措施。我國抗枯萎病育種的進展與大豆生產需求現狀相差甚遠，主要原因是研究方法和手段相對落后，有關的基礎研究，如尖鐮孢菌的鑒定、遺傳多樣性、抗性鑒定等研究不夠系統(tǒng)和深入。

2、r>　　 本研究在大豆枯萎病發(fā)生時期，從全國主要大豆種植地區(qū)采集大豆枯萎病病樣，采用傳統(tǒng)形態(tài)鑒定和分子生物學手段相結合的方法，對大豆枯萎病病原菌進行分離鑒定，建立了尖鐮孢菌的快速分子檢測體系，同時對大豆枯萎病病原菌的遺傳多樣性和品種抗性進行了研究。
　　 1.從我國各大豆產區(qū)采集大豆枯萎病標本285份，通過室內分離、培養(yǎng)獲得126株真菌分離物。按照柯赫氏法則，經過致病性試驗證實，得到97株致病菌。經傳統(tǒng)形態(tài)學和分子生物學鑒定，

3、得到61株尖鐮孢菌(Fusarium oxysporum)。
　　 2.根據尖鐮孢菌(F.oxysporum)和其它病原真菌的甾醇14α-去甲基化酶基因(CYP51C)序列間的差異，設計了特異性引物C1/C2和C3/C4。檢測體系可以特異地從F.oxysporum菌株中擴增到一條699 bp左右的條帶。引物C1/C2對F.oxysporum基因組DNA的檢測靈敏度為100ng，以引物C3/C4和C1/C2進行套式PCR擴增后，檢

4、測靈敏度提高到1 pg，檢測靈敏度至少提高105倍。引物C1/C2對土壤中分生孢子的檢測靈敏度達到102個孢子/克土，套式PCR檢測體系可以將靈敏度提高到1個孢子/克土。同時，引物C1/C2對發(fā)病植株組織也能特異性的檢測到F.oxysporum的存在。進一步建立了實時熒光定量PCR檢測體系，可以對土壤和發(fā)病植物中病原菌精確定量。
　　 3.利用隨機擴增多態(tài)性DNA(RAPD)，對采自我國不同地區(qū)的大豆枯萎病病原菌尖鐮孢菌(F.o

5、xysporum)進行遺傳多樣性分析，篩選到10條多態(tài)性隨機引物，共產生75條RAPD條帶，其中55條為多態(tài)性條帶，占73.3％。利用UPGMA法對DNA擴增圖譜進行聚類分析，以遺傳距離0.68為閾值，55個菌株可分為9個遺傳群體，表明我國大豆枯萎病病原菌中具有豐富的種內遺傳多樣性。
　　 4.采用孢子懸浮液蘸根接種鑒定方法，對172份大豆品種進行抗枯萎病鑒定篩選，鑒定得到5份抗大豆枯萎病品種:皖豆28，中黃13，中黃51，中作