紫花苜蓿光敏色素B基因片段克隆及RNA干擾表達載體的構建.pdf

1、紫花苜蓿作為一種重要的豆科牧草日益受到重視。其秋眠性與抗寒性和生產(chǎn)性能相關,成為各地選擇適宜品種的首要指標。苜蓿的秋眠存在著光周期效應,而光敏色素是光周期反應的受體。光敏色素B又是植物中重要的光受體,因此我們推測光敏色素B與苜蓿的秋眠性存在一定的聯(lián)系,以此為研究出發(fā)點,希望探明苜蓿秋眠性的分子機理。本研究采用植物RNA干擾技術,目的是通過構建RNA干擾載體來抑制phyB基因的表達,再對轉基因植株的表型及光調節(jié)特性進行分析,以研究phyB

2、的功能及苜蓿秋眠的分子調控機理。主要結果如下:
　　 試驗一、成功提取了紫花苜蓿2級品種Vernal的總RNA,通過設計引物,PCR擴增出所需的光敏色素B目的基因片段(333bp),純化回收目的基因,并克隆到克隆載體pGEM-T Easy中。經(jīng)PCR產(chǎn)物檢測,ClaⅠ,XbaⅠ,和KpnⅠ、XhoⅠ雙酶切鑒定正反向目的片段及測序結果分析,證實插入片段的DNA序列與Genbank中已公布的蒺藜狀苜?；蛐蛄小⒆匣ㄜ俎L-525H

3、Q和Vernal光敏色素B的序列相似度均高達96％以上,可以進行后續(xù)試驗。分別對含正向、反向片段的重組質粒雙酶切,得到回收純化后的產(chǎn)物,為RNAi載體的構建準備材料。
　　 試驗二、正向片段與ClaⅠ,xbaⅠ雙酶切過的中間載體pHANNIBAL相連接,得到“中間載體pHANNIBAL/正向”載體；對其用KpnⅠ,XhoⅠ雙酶切和純化回收,與反向片段相連,得到“中間載體pHANNIBAL/正向/反向”載體,經(jīng)PCR檢測、酶切鑒定