魚(yú)類(lèi)P450誘導(dǎo)劑和抑制劑在草魚(yú)體內(nèi)外對(duì)雙氟沙星N-脫甲基化代謝的影響.pdf

1、細(xì)胞色素P450(CYP)是動(dòng)物體內(nèi)代謝藥物的重要的酶。CYP1A、3A和2E的誘導(dǎo)和抑制作用己被廣泛研究，其誘導(dǎo)劑和抑制劑已經(jīng)比較明了，但關(guān)于魚(yú)類(lèi)P450誘導(dǎo)劑和抑制劑對(duì)雙氟沙星N-脫甲基化影響的研究卻未見(jiàn)報(bào)道。本文采用RP-HPLC的方法研究了魚(yú)類(lèi)P450的典型誘導(dǎo)劑和抑制劑對(duì)雙氟沙星N-脫甲基化影響，預(yù)測(cè)了參與雙氟沙星N-脫甲基化代謝的主要的P450酶。本論文的研究?jī)?nèi)容分為五章：第一章是草魚(yú)肝和腎中雙氟沙星和沙拉沙星共檢出方法的比

2、較研究；第二章是魚(yú)類(lèi)誘導(dǎo)劑和抑制劑在體外對(duì)雙氟沙星N-脫甲基化的作用；第三章是魚(yú)類(lèi)誘導(dǎo)劑和抑制劑在體內(nèi)對(duì)雙氟沙星N-脫甲基化的作用：第四章是雙氟沙星對(duì)草魚(yú)肝和腎組織的損傷模型的初步建立；第五章是實(shí)驗(yàn)用魚(yú)的多功能口服給藥裝置的專(zhuān)利申請(qǐng)。主要內(nèi)容如下：
　　 1草魚(yú)肝和腎中雙氟沙星和沙拉沙星共檢出方法的比較研究
　　 以草魚(yú)肝和腎組織為研究對(duì)象，比較了反相高效液相色譜法測(cè)定同時(shí)測(cè)定雙氟沙星和沙拉沙星的內(nèi)標(biāo)法和外標(biāo)法。外標(biāo)法和

3、內(nèi)標(biāo)法(以諾氟沙星為內(nèi)標(biāo))均采用有機(jī)溶劑二氯甲烷提取樣品中的藥物，45℃吹干，流動(dòng)相溶解，正已烷去脂，反相高效液相色譜法測(cè)定其中的藥物濃度。利用外標(biāo)法測(cè)得DIF的平均回收率在肝和腎中分別為82.41％和82.13％，各樣品日內(nèi)變異系數(shù)分別小于4.79％和4.92％；SAR的平均回收率在肝和腎中分別為82.02％和81.94％，各樣品日內(nèi)變異系數(shù)分別小于4.96％和5.06％；利用內(nèi)標(biāo)法測(cè)得DIF的平均同收率在肝和腎中分別為82.32％和

4、82.17％，各樣品日內(nèi)變異系數(shù)分別小于4.92％和4.73％：SAR的平均回收率在肝和腎中分別為82.06％和82.13％，各樣品日內(nèi)變異系數(shù)分別小于4.92％和4.52％。外標(biāo)法測(cè)得肝中DIF和SAR的LOD為0.01和0.02μg·g-1，腎中DIF和SAR的LOD為0.02和0.05μg·g-1，肝和腎中DIF和SAR的LOQ均為0.05μg·g-1：內(nèi)標(biāo)法測(cè)得肝中DIF和SAR的LOD均為0.02μg·g-1，腎中DIF和SA

5、R的LOD為0.02和0.05μg·g-1，肝和腎中DIF和SAR的LOQ均為0.05μg·g-1。綜合內(nèi)標(biāo)法和外標(biāo)法的優(yōu)缺點(diǎn)和上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)選擇外標(biāo)法檢測(cè)肝和腎組織中雙氟沙星和沙拉沙星的含量。
　　 2雙氟沙星對(duì)草魚(yú)肝細(xì)胞和腎細(xì)胞的毒性實(shí)驗(yàn)
　　 細(xì)胞的傳代培養(yǎng)、凍存與復(fù)蘇采用實(shí)驗(yàn)室常規(guī)的方法。細(xì)胞中蛋白含量檢測(cè)采用Lowry法，肝細(xì)胞中蛋白濃度為0.39mg/ml細(xì)胞，腎巾蛋白濃度為0.35mg/ml細(xì)胞。采用

6、MTT法分析了雙氟沙星在濃度分別為3.9、7.81、15.6、31.25、62.5、125、250、500和1000μM，對(duì)草魚(yú)肝細(xì)胞和腎細(xì)胞分別作用1h、2h、6h、12h、24h和48h之后，其結(jié)果表明肝細(xì)胞和腎細(xì)胞中選擇DIF濃度為3.9～125μM和細(xì)胞孵育的時(shí)間為1～6h，作為后續(xù)優(yōu)化DIF N-脫甲基化代謝研究的最高非致死濃度，為進(jìn)一步研究雙氟沙星在肝和腎細(xì)胞中最佳代謝時(shí)間和濃度提供依據(jù)。
　　 3魚(yú)CYP誘導(dǎo)劑在草

7、魚(yú)肝細(xì)胞和腎細(xì)胞中對(duì)雙氟沙星N-脫甲基的作用
　　 為獲得有關(guān)CYP誘導(dǎo)的信息，本研究采用RP-HPLC的方法在GCL和CIK細(xì)胞中測(cè)定了CYP(s)的特異性誘導(dǎo)劑對(duì)DIF的代謝作用及酶動(dòng)學(xué)分析。GCL的BNF處理組導(dǎo)致了DIF代謝水平5.1倍增加，而RIF處理組引起DIF代謝水平2.5倍增加，EA處理組對(duì)DIF代謝水平?jīng)]有明顯改變，BNF誘導(dǎo)組和對(duì)照組的酶動(dòng)學(xué)方程分別為1/V=0.0157×1/[S]+0.001和1/V=0.

8、0673×1/[S]+0.0029，與對(duì)照相比，BNF導(dǎo)致Vmax1.9倍增加，Clint3.3倍增加。而在CIK中，DIF與經(jīng)BNF處理的CIK共孵育后，DIF的N-脫甲基化代謝水平有3倍增加，BNF誘導(dǎo)組和對(duì)照組的酶動(dòng)學(xué)方程分別為1/V=0.0245×1/[S]+0.0013和1/V=0.1375×1/[S]+0.003,酶動(dòng)學(xué)參數(shù)Clint和Vmax值分別增加了6倍和2倍，EA和RIF誘導(dǎo)組均使對(duì)Clint和Vmax值改變很小。B

9、NF是魚(yú)類(lèi)CYP1A的特異性誘導(dǎo)劑，RIF是魚(yú)類(lèi)CYP3A的強(qiáng)的誘導(dǎo)劑，因此，在本研究條件下，CYP1A和3A參與了GCL的DIF N-脫甲基化代謝，CYP1A參與了CIK中DIF的N-脫甲基化代謝。
　　 4魚(yú)類(lèi)誘導(dǎo)劑和抑制劑在體內(nèi)對(duì)雙氟沙星N-脫甲基化的作用
　　 通過(guò)用魚(yú)類(lèi)典型的誘導(dǎo)劑BNF(CYP1A)、EA(CYP2E)和RIF(CYP3A)和強(qiáng)抑制劑ANF(CYP1A), EF(CYP2E)和KTZ(CYP3

10、A)對(duì)DIF N-脫甲基化的作用。采用RP-HPLC方法檢測(cè)DIF的代謝產(chǎn)物SAR的產(chǎn)量，間接反應(yīng)CYP酶對(duì)組織樣品中DIF-脫甲基化活性。SAR的生成量表明，在草魚(yú)的肝和腎中，ANF和BNF組在第三天時(shí)分別達(dá)到最大抑制和誘導(dǎo)，BNF誘導(dǎo)組的誘導(dǎo)率和ANF的抑制率高于25％。EA、EF、RIF和KTZ處理草魚(yú)，抑制和誘導(dǎo)率低于20％。酶動(dòng)學(xué)參數(shù)表明，在腎中BNF引起Vmax和Clint0.56和0.38倍增加，而在肝中BNF引起Vmax

11、和Clint兩者都有1倍增加，EA和RIF處理組的Vmax和Clint與對(duì)照相比，差異不顯著。在肝和腎中，ANF預(yù)處理的DIF脫甲基化抑制的Lineweaver-Burk plot表明了混合類(lèi)型的抑制，而EF和KTZ沒(méi)有顯示對(duì)DIF脫甲基化的抑制效應(yīng)。ANF對(duì)魚(yú)腎中DIF的代謝的抑制常數(shù)(Ki)為12.9mg/kg體重，而ANF對(duì)魚(yú)肝中DIF的代謝的抑制常數(shù)(Ki)為12.53mg/kg體重。綜上，由于BNF和ANF分別為CYP1A的誘

12、導(dǎo)劑和抑制劑，CYP1A參與了草魚(yú)肝和腎中的DIF的N-脫甲基化。
　　 5雙氟沙星對(duì)草魚(yú)肝和腎組織的損傷模型的初步建立
　　 有些藥物或毒物可通過(guò)許多方式對(duì)肝臟和腎臟造成損害。喹諾酮類(lèi)藥物對(duì)魚(yú)類(lèi)組織損傷模型未見(jiàn)報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)研究了雙氟沙星對(duì)草魚(yú)肝臟和腎臟組織損傷的具體組織病理學(xué)變化。給草魚(yú)連續(xù)灌20mg/kg的雙氟沙星20天后，在觀(guān)察癥狀和剖檢變化后，以后對(duì)存活的魚(yú)取其肝臟組織和腎臟組織，進(jìn)行石蠟切片，HE染色，顯微鏡觀(guān)

13、察。眼觀(guān)無(wú)病變，顯微病變?yōu)楦闻K毛細(xì)血管充血，肝細(xì)胞出現(xiàn)空泡變性或玻璃樣變性。腎臟有出血，腎曲小管組織溶解，機(jī)化或化生，腎小球的細(xì)胞核腫脹。雙氟沙星對(duì)草魚(yú)肝和腎組織的損傷模型的初步建立為探知肝臟和腎臟疾病的病因、病理等提供有力的工具。
　　 6實(shí)驗(yàn)用魚(yú)的多功能口服給藥裝置的專(zhuān)利設(shè)計(jì)
　　 給魚(yú)灌藥的過(guò)程中，現(xiàn)存管制裝置容易使胃腸液和液體漁藥溢出，并且末端容易損傷魚(yú)的腸胃。針對(duì)這些難題，設(shè)計(jì)了一實(shí)用新型專(zhuān)利。已獲得專(zhuān)利受理申