內(nèi)源性綿羊肺腺瘤env基因的克隆和原核表達.pdf

1、研究背景：內(nèi)源性綿羊肺腺瘤病毒(endogenous jaagsiekte sheep retrovirus,enJSRV)序列與外源性綿羊肺腺瘤病毒序列密切相關。在綿羊肺腺瘤病的發(fā)病過程中，雖然enJSRV不對OPC的發(fā)生有直接地致瘤作用，但是在正常羊的個體發(fā)育過程中，enJSRV的表達可能會對exJSRV的感染和OPA（Ovine pulmonary adenomatosis）疾病的發(fā)生有影響。
　　實驗目的：克隆內(nèi)源性綿羊肺

2、腺瘤病毒的env基因，將內(nèi)源性env基因重組進入原核表達體系中，嘗試誘導內(nèi)源性env基因進行原核表達。為制備內(nèi)源性env基因多克隆抗體奠定基礎。
　　研究方法：參照GenBank上已發(fā)表的內(nèi)源性綿羊肺腺瘤病毒env基因與3’長末端重復序列保守區(qū)序列設計引物，以正常地綿羊肺臟基因組為模板，應用PCR技術擴增內(nèi)源性綿羊肺腺瘤env基因與3’長末端重復序列；將克隆的內(nèi)源性env基因通過相應的酶切位點，亞克隆到原核表達載體pET-32a中

3、，再轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21中后用IPTG誘導表達。通過SDS-PAGE分析內(nèi)源性env基因編碼的蛋白表達并應用Western-Blotting鑒定。用鎳柱純化內(nèi)源性env基因編碼表達的蛋白并應用Western Bloting鑒定。
　　實驗結(jié)果表明：利用PCR成功擴增內(nèi)源性env基因與3’長末端重復序列，測序得目的片段長度為2249bp，與預期片段長度一致；內(nèi)源性env基因在原核表達體系中可以少量表達，其原核表達蛋白的表觀分子量為

4、89kDa；對內(nèi)源性env基因編碼表達的蛋白質(zhì)經(jīng)Western-Blotting鑒定，實驗成功表達內(nèi)源性env基因編碼的蛋白；用鎳柱純化內(nèi)源性env基因編碼表達的蛋白，通過Western Bloting鑒定表明純化結(jié)果僅有一條帶。
　　綜上所述，在我國，此次實驗首次克隆了內(nèi)源性env基因，并將內(nèi)源性和外源性env基因進行比較。嘗試表達內(nèi)源性env基因編碼的蛋白質(zhì)，為進一步研究env基因在綿羊肺腺瘤疾病的感染，疾病發(fā)生、發(fā)展中，以及