抗BmNPV誘導型啟動子轉基因干涉載體的構建.pdf

1、家蠶核型多角體病是由家蠶核型多角體病毒(Bombyx mori nuclearpolyhedrosisvirus，BmNPV)感染家蠶所引起的一種傳染性蠶病，是蠶業(yè)生產上的主要病害，極大地危害了蠶業(yè)生產。提高家蠶品種對病毒的抵抗性和培育抗病品種是防治傳染性蠶病的有效措施。RNAi所介導的基因沉默能抑制病毒基因的復制，其與轉基因技術相結合為培育抗病毒家蠶品種提供了新的方法。利用強的組成型啟動子雖能提高RNAi效率，但是外源基因的組成性表達

2、對轉基因家蠶的發(fā)育會造成一定的影響。因此篩選合適的啟動子，構建穩(wěn)定表達dsRNA的載體，在提高dsRNA表達水平的同時減少外源基因組成性表達的負荷，將為最終獲得具有BmNPV高度抗性的轉基因家蠶育種素材奠定基礎。本文通過熒光素酶報告基因載體pGL3對所選擇的誘導型啟動子(plef3和p39k)進行檢測，構建了抗BmNPV誘導型啟動子轉基因干涉載體。主要的研究結果如下：
　　 1、誘導型啟動子的選擇與克隆
　　 根據文獻報

3、道及桿狀病毒的級聯(lián)調控特征，對于BmNPV基因啟動子進行分析，初步選擇并克隆了39k基因和lef3基因的啟動子區(qū)域。測序結果顯示：所克隆的啟動子均包含啟動子轉錄核心區(qū)域，存在明顯的桿狀病毒啟動子特征序列，含有TATA框，加帽位點，早期基因轉錄起始位點的保守序列(CAGT)，翻譯起始密碼子ATG等，序列上符合真核生物啟動子的特點。
　　 2、啟動子活性檢測
　　 利用連接有BmNPV的39k及l(fā)ef3啟動子的熒光素酶報告基

4、因重組載體pGL3-39k及pGL3-lef3轉染Sf9及BmE-SWU1兩種細胞，檢測了兩種啟動子的活性。發(fā)現(xiàn)當在AcMNPV及BmNPV兩種桿狀病毒感染宿主細胞時，均會誘導BmNPV的39k啟動子的活性上調。在異源細胞Sf9中的組成型活性較低，但病毒感染后的誘導活性會大大提高(相對酶活由0.411提高到64.9268，感染后約為感染前的158倍)。同樣的，在宿主細胞BmE-SWU1被病毒感染后的39k啟動子活性增加(相對酶活由6.0

5、151提高到12.6497，感染病毒后約為感染病毒前的2.103倍)。并且39k啟動子活性在Sf9細胞中的組成型活性非常低，但在BmE-SWU1中組成型活性較高。而lef3啟動子在有無病毒感染的情況時活性均遠遠低于39k啟動子活性(P＜0.01)。進一步在BmE-SWU1細胞中測定了39k啟動子在轉染后各個時間點的活性，發(fā)現(xiàn)隨著時間的推移，39k啟動子的表達不斷提高且感染BmNPV的組中39k啟動子的活性明顯高于未感染BmNPV的組中3

6、9k啟動子的活性(P＜0.01)
　　 3、轉基因RNAi干涉載體的構建及細胞水平上的抗病毒檢測
　　 分析確定了RNAi載體的結構，構建了可以在家蠶細胞中產生穩(wěn)定的雙鏈發(fā)夾狀RNA(hpRNA)的轉基因RNAi載體。進一步利用抗生素G418對于瞬時轉染轉基因載體的家蠶細胞進行篩選培養(yǎng)，近4個月后建立了穩(wěn)定轉化的轉基因細胞系，接種Bm-BacPAK6病毒后，檢測了病毒的增殖情況。研究表明：當用較高的病毒濃度滴度(1.01