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文檔簡介
1、白葉枯病是僅次于稻瘟病的水稻第二大病害,Xa21是最早發(fā)現(xiàn)的白葉枯病抗性基因,具廣譜抗性,其無毒基因ax21在2009年底被確定。ax21翻譯產物Ax21(activator of XA21-mediated immunity)為194個氨基酸的蛋白質,包含外泌信號肽,硫酸化17肽axY(s)22,后續(xù)多肽鏈三個部分。Ax21是目前發(fā)現(xiàn)首個直接作用于宿主受體,引發(fā)抗性反應的群體感應因子,也是革蘭氏陰性菌中首次發(fā)現(xiàn)的介導調控運動,生物膜形
2、成,毒力相關基因表達的群體感應因子。目前,已相繼發(fā)現(xiàn)raxST,RaxP,RaxH等十余個基因參與Ax21的翻譯及活性調控。
研究發(fā)現(xiàn),Ax21硫酸化17肽是引起水稻抗性的活性物質,Ax21的成熟必須經(jīng)N端第22位酪氨酸的硫酸化修飾,Ⅰ類分泌系統(tǒng)(typeⅠ secretion system,TOSS)分泌出胞外,蛋白酶切去后續(xù)多肽鏈等過程。為探究Ax21成熟機理,我們主要進行了三部分的研究工作:Ax21硫酸化部位定位與酶
3、切部位定位;RaxST與Ax21蛋白的表達純化;農桿菌介導SAC基因轉化水稻。
研究表明RaxST利用PAPS作為硫酸根的供體催化Ax21的硫酸化。構建raxST C端具CFP的單交換載體pSKB4-raxST-CFP,電轉化至感受態(tài)白葉枯病菌PXO99,經(jīng)氨芐青霉素抗性篩選獲得單交叉重組菌株。通過熒光顯微鏡觀察,發(fā)現(xiàn)CFP熒光信號位于胞內,推測Ax21的硫酸化發(fā)生于白葉枯病菌細胞內。蛋白酶切去后續(xù)多肽是Ax21成熟的必須
4、過程,構建了Ax21 C端具GFP的單交換載體pSKB4-ax21-GFP,通過電轉化至感受態(tài)白葉枯病菌PXO99,經(jīng)氨芐青霉素抗性篩選獲得單交叉重組菌株。通過熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)GFP熒光信號位于胞內,推測Ax21的蛋白酶切發(fā)生在胞內,或GFP的存在影響了Ax21的分泌。
Ax21硫酸化由RaxST催化完成,目前尚沒有對RaxST的催化活性及反應具體條件進行分析。我們分別把Ax21與RaxST構建到原核表達載體pET30a
5、與pSKB4中,高效表達Ax21與RaxST蛋白,電泳發(fā)現(xiàn)Ax21與RaxST均存在于包含體。通過尿素溶解,復性純化,我們得到了較高純度的Ax21與RaxST蛋白,為Ax21體外硫酸化活性分析奠定了基礎。
硫是生命活動必須的化學元素,研究表明許多含硫化合物參與了植物細胞的防衛(wèi)反應,大田實驗也表明硫可以誘導植物抗病性的產生。Ax21的成熟也必須經(jīng)歷硫酸化修飾,本實驗室研究表明,施硫量的多少,影響水稻對白葉枯病的抗性。利用轉基
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