重組豬乳鐵蛋白N端的高效表達(dá)及抑菌活性檢測(cè).pdf

1、乳鐵蛋白（Lactoferrin，LF）是一種天然活性鐵離子結(jié)合糖蛋白，廣泛存在于動(dòng)物的乳汁（初乳）、血液、唾液、小腸液等外分泌液或血漿、中性粒細(xì)胞中。乳鐵蛋白具有抗微生物、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)等功能。LF對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的抑制作用被認(rèn)為是清除介質(zhì)中的鐵，由于細(xì)菌需要鐵離子以維持生長(zhǎng)，因此乳鐵蛋白在結(jié)合鐵離子的同時(shí)起到了抑制需鐵細(xì)菌的生長(zhǎng)，進(jìn)而導(dǎo)致病原菌死亡。
　　 本研究將乳鐵蛋白N端基因在大腸桿菌中進(jìn)行了表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物主要以包涵體

2、的形式存在，通過(guò)對(duì)包涵體的提取、純化、尿素梯度透析復(fù)性和復(fù)性條件的摸索，選擇最佳復(fù)性條件進(jìn)行蛋白復(fù)性，將復(fù)性后的蛋白進(jìn)行了細(xì)菌抑菌活性檢測(cè)，表明表達(dá)的豬乳鐵蛋白具有明顯的抑菌作用。主要結(jié)果如下：
　　 通過(guò)RT-PCR方法從泌乳三天的長(zhǎng)白豬乳腺組織中擴(kuò)增獲得了天然豬乳鐵蛋白N端基因，序列測(cè)定結(jié)果顯示基因全長(zhǎng)為1077bp，與GenBank上發(fā)表的AY306198.1、M81327.1、L77887.1、M92089.1四株豬乳鐵

3、蛋白核苷酸序列的同源性約達(dá)99％以上。將PLF-N基因定向插入到原核表達(dá)載體pET-30b中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，在大腸桿菌中進(jìn)行了誘導(dǎo)表達(dá)，獲得了約42KDa的目的蛋白，蛋白表達(dá)量占全菌體蛋白的10％，表明表達(dá)有待提高。
　　 為了提高PLF-N基因的表達(dá)量，以天然PLF-N基因?yàn)槟０?，通過(guò)密碼子優(yōu)化全基因合成了豬乳鐵蛋白N端基因，優(yōu)化后的基因命名為PLF-NS，并以相同的條件重新在大腸桿菌中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，優(yōu)化后的PLF-N

4、S基因得到了高效表達(dá)，并對(duì)表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化，表明在28℃，經(jīng)0.4mmol/LIPTG誘導(dǎo)3小時(shí)表達(dá)量最大，占菌體總蛋白的32％；通過(guò)Western-blot進(jìn)一步分析表明豬乳鐵蛋白得到了正確表達(dá)，其產(chǎn)物分子量約為42 kDa，表達(dá)產(chǎn)物以包涵體形式存在。包涵體經(jīng)提取和純化后，純度達(dá)到98％以上。將純化后的重組蛋白進(jìn)行透析復(fù)性，進(jìn)行了不同復(fù)性條件的摸索，結(jié)果表明采用TE緩沖液體系，在4℃條件下，pn值為9.0，蛋白濃度為0.05mg/mL

5、，β-巰基乙醇濃度為35mmol/L，復(fù)性液中尿素梯度變化為6M、4M、2M、1.5M、1M、0.5M、0M時(shí)，蛋白的復(fù)性率最高，回收率可以達(dá)到40％。
　　 體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果表明得到的重組豬乳鐵蛋白N端有明顯的抑菌活性，通過(guò)抑菌圈法測(cè)量其活性表明重組蛋白對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌如金黃色葡萄球菌、李氏桿菌、枯草芽孢桿菌、豬鏈球菌、革蘭氏陰性菌如大腸桿菌、沙門(mén)氏菌和巴氏桿菌均有抑菌活性，但對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的抑菌活性強(qiáng)于對(duì)革蘭氏陰性菌的抑菌活性