腸道菌對(duì)蘇云金芽胞桿菌棉鈴蟲(chóng)殺蟲(chóng)活性的作用.pdf

1、蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis)由于在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中會(huì)伴隨芽胞的形成而高效表達(dá)對(duì)昆蟲(chóng)具有特異毒性的殺蟲(chóng)晶體蛋白,被廣泛應(yīng)用于害蟲(chóng)防治上。在探討蘇云金芽胞桿菌殺蟲(chóng)機(jī)制的過(guò)程中,很多研究者認(rèn)為昆蟲(chóng)腸道共生菌是殺蟲(chóng)活性所必須,也有研究者提出與此相反的觀點(diǎn),形成了百家爭(zhēng)鳴的局面。本文以棉鈴蟲(chóng)為供試?yán)ハx(chóng),以棉鈴蟲(chóng)腸道共生菌為切入點(diǎn),來(lái)探究昆蟲(chóng)腸道共生菌在蘇云金芽胞桿菌發(fā)揮毒力的過(guò)程中所扮演的角色,從而求證棉鈴蟲(chóng)腸道共

2、生菌是否為蘇云金芽胞桿菌發(fā)揮毒力所必須。
　　 首先,從人工飼養(yǎng)的普通棉鈴蟲(chóng)腸道環(huán)境分離得到了9株細(xì)菌,其中8株革蘭氏陽(yáng)性球菌,1株革蘭氏陰性球菌。從不同細(xì)菌出現(xiàn)的數(shù)量和在棉鈴蟲(chóng)不同齡期的分布特征可以知道,3號(hào)菌出現(xiàn)的頻率較高,2號(hào)菌和7號(hào)菌在腸道內(nèi)數(shù)量較多,達(dá)到了108,2號(hào)、3號(hào)和7號(hào)菌是棉鈴蟲(chóng)腸道的優(yōu)勢(shì)菌群。
　　 其次,用滅菌的普通飼料中加入終濃度為500μg/mL的氨芐青霉素(Amp)、鏈霉素(Str)、利福霉

3、素(Rif)和慶大霉素(Gen)的方法來(lái)獲得無(wú)腸道共生菌的棉鈴蟲(chóng)。通過(guò)稀釋涂布法發(fā)現(xiàn)普通飼料飼養(yǎng)的棉鈴蟲(chóng)腸道解剖液在NA平板上會(huì)有黃色、白色或者紅色菌落出現(xiàn),無(wú)菌飼料飼養(yǎng)的棉鈴蟲(chóng)腸道解剖液在NA平板上沒(méi)有菌落出現(xiàn)。說(shuō)明無(wú)菌飼料飼養(yǎng)的棉鈴蟲(chóng)腸道內(nèi)沒(méi)有可培養(yǎng)的細(xì)菌存在。通過(guò)液體富集法發(fā)現(xiàn)普通飼料飼養(yǎng)的棉鈴蟲(chóng)腸道第二次富集液平均OD600為1.773,無(wú)菌飼料飼養(yǎng)的棉鈴蟲(chóng)腸道第二次富集液平均OD600為0.004。進(jìn)一步說(shuō)明無(wú)菌飼料飼養(yǎng)的棉鈴

4、蟲(chóng)腸道內(nèi)沒(méi)有可培養(yǎng)的細(xì)菌存在。提取普通飼料和無(wú)菌飼料飼養(yǎng)的棉鈴蟲(chóng)腸道總DNA,擴(kuò)增16S rDNA,結(jié)果顯示普通飼料飼養(yǎng)的1齡、2齡和3齡棉鈴蟲(chóng)都有1.5 kb的條帶出現(xiàn),無(wú)菌飼料飼養(yǎng)的1齡、2齡和3齡棉鈴蟲(chóng)都沒(méi)有特異性條帶的出現(xiàn)。說(shuō)明用滅菌飼料中加入抗生素的方法可以將棉鈴蟲(chóng)腸道內(nèi)細(xì)菌消除。
　　 同時(shí)比較用普通飼料飼養(yǎng)的棉鈴蟲(chóng)和無(wú)菌飼料飼養(yǎng)的棉鈴蟲(chóng)的生長(zhǎng)狀態(tài)和存活率。相同條件下飼養(yǎng)的相同批次的不同組棉鈴蟲(chóng)生長(zhǎng)狀態(tài)和存活率接近。

5、普通飼料飼養(yǎng)的棉鈴蟲(chóng),3齡和6齡時(shí)的平均體重分別為38.75 mg/頭和223.25 mg/頭,平均存活率分別為90.25％和86.00％;無(wú)菌飼料飼養(yǎng)的棉鈴蟲(chóng),3齡和6齡時(shí)的平均體重分別為37.50 mg/頭和231.00 mg/頭,平均存活率分別為89.50％和87.00％。
　　 隨后,用Cry1Ac10毒素蛋白對(duì)普通棉鈴蟲(chóng)和無(wú)腸道共生菌棉鈴蟲(chóng)進(jìn)行生物測(cè)定實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明,Cry1Ac10毒素蛋白對(duì)普通棉鈴蟲(chóng)和無(wú)腸道共生菌棉

6、鈴蟲(chóng)的LC50分別為0.0579±0.0389 mg/mL和0.0143±0.0054 mg/mL,對(duì)兩種品系的棉鈴蟲(chóng)都有較高的毒力,而且Cry1Ac10毒素蛋白對(duì)無(wú)腸道共生菌棉鈴蟲(chóng)的毒力遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于對(duì)普通棉鈴蟲(chóng)的毒力,是普通棉鈴蟲(chóng)毒力的4倍。
　　 將從普通棉鈴蟲(chóng)腸道篩選得到編號(hào)為3號(hào)的細(xì)菌,活化后混勻到無(wú)菌感染飼料中,感染棉鈴蟲(chóng)幼蟲(chóng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),3號(hào)菌可以降低無(wú)腸道共生菌棉鈴蟲(chóng)對(duì)Cry1Ac10的敏感性,使無(wú)腸道共生菌棉鈴蟲(chóng)的死亡