兩種Bt融合基因抗蟲性能及其轉(zhuǎn)基因水稻的研究.pdf

1、隨著轉(zhuǎn)Bt(蘇云金芽孢桿菌,Bacillus thuringiensis)基因抗蟲作物的廣泛應(yīng)用,人們對昆蟲抗性發(fā)生的憂慮日益激增,對抗性管理的研究也越來越深入。目前在分子水平使用的抗性管理策略主要是基因堆疊,即將兩種或更多作用位點(diǎn)不同,無交叉抗性的Bt基因同時在一種作物中表達(dá)。這種策略己被證明能夠顯著延緩抗性發(fā)生。同時,多基因的使用,還可以使轉(zhuǎn)基因作物同時應(yīng)對多種害蟲,可謂一舉兩得?；蚨询B有兩種實(shí)現(xiàn)方式,一種比較常見,是將多種基因獨(dú)

2、立的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。而另一種是將兩種基因拼接起來,通過一個啟動子轉(zhuǎn)錄表達(dá)。一般認(rèn)為,兩種Bt基因融合的效果等同于兩種親本蛋白的疊加。
　　 cry1Ab和cry9Aa基因,氨基酸序列相似度低于30％,理論上講受體結(jié)合位點(diǎn)可能不同,因此不會出現(xiàn)交叉抗性。我們選取這兩個cry基因,去除兩者原蛋白結(jié)構(gòu)域ⅢC端的編碼基因,保留其經(jīng)典3結(jié)構(gòu)域(Ⅰ,Ⅱ和Ⅲ)的活性部分。然后將兩個截?cái)嗟幕蚱唇悠饋?形成融合基因,cryIAb-cry9Aa。大腸桿

3、菌(Escherichia coli)表達(dá)的融合蛋白CrylAb-Cry9Aa生物測定顯示,該蛋白對粘蟲(Mythimna separate)和亞洲玉米螟(Ostrinia furnacatis)具有很好的殺蟲活性,其LC50遠(yuǎn)低于其親本蛋白Cry1Ab和Cry9Aa。對棉鈴蟲(Helicoverpa armigera)和斜紋夜蛾(Spodoptera litura)的生測結(jié)果顯示,Cry1Ab和Cry9Aa蛋白對其沒有明顯的殺蟲或抑制

4、作用,但融合蛋白Cry1Ab-Cry9Aa對兩種昆蟲具有顯著生長抑制作用。其中,喂養(yǎng)Cry1Ab-Cry9Aa蛋白(5μg／cm2)的棉鈴蟲平均體重只有空白對照的十分之一,而斜紋夜蛾約為5分之一。我們進(jìn)一步將Cry9Aa的N端59個氨基酸去除,得到Cry9AaDel蛋白。同時將Cry1Ab和Cry9AaDel融合形成Cry1Ab-Cry9AaDel蛋白。生物測定顯示,Cry9AaDel完全失去對粘蟲和亞洲玉米螟的活性,但是,相應(yīng)的融合蛋

5、白Cry1Ab-Cry9AaDel卻依然保持對兩種昆蟲的高效殺蟲活性。另外,Cry9AaDel對棉鈴蟲和斜紋夜蛾也無任何活性,但融合蛋白Cry1Ab-Cry9AaDel也表現(xiàn)出同Cry1Ab-Cry9Aa蛋白相近的抑制作用。
　　 為了測定兩種融合蛋白對四種害蟲的生物活性是否由于其親本蛋白之間的協(xié)同作用,我們同時將各自的兩種親本蛋白混合進(jìn)行生物測定。結(jié)果顯示,Cry1Ab和Cry9Aa或Cry9AaDel之間并無協(xié)同作用。兩種融

6、合蛋白對四種害蟲的生物活性,也遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于混合處理。該結(jié)果說明我們構(gòu)建的兩種融合蛋白Cry1Ab-Cry9Aa和Cry1Ab-Cry9AaDel獲得了更高的生物活性,具有潛在應(yīng)用價值。
　　 為了進(jìn)一步確認(rèn)兩種融合蛋白在轉(zhuǎn)基因領(lǐng)域的應(yīng)用潛力,我們將兩種融合基因分別轉(zhuǎn)化水稻品種粳稻秀水110。分析陽性轉(zhuǎn)化水稻中融合蛋白的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)兩種融合蛋白在水稻中均能較好表達(dá)。不同轉(zhuǎn)化株系之間表達(dá)量差異較大(0.2-2μg每克新鮮葉片)。另外,

7、在水稻里表達(dá)的融合蛋白,部分被水稻自身的蛋白酶消化,降解為較小的片段,該現(xiàn)象也已有其它相似的報(bào)道。對四種害蟲,棉鈴蟲、斜紋夜蛾、二化螟(Chilo,suppressalis)和稻縱卷葉螟(Cnaphalocrocis medinalis)等一齡幼蟲進(jìn)行生物測定顯示,兩種轉(zhuǎn)基因水稻都獲得了優(yōu)秀的抗蟲能力。進(jìn)一步使用單拷貝轉(zhuǎn)化株系的T1代植株測定二齡斜紋夜蛾幼蟲,也表現(xiàn)出很好的抗性。
　　 綜上所述,獲得了兩種Bt融合蛋白Cry1A