小麥TaPHR1基因表達(dá)載體的構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化研究.pdf

1、充分挖掘作物高效利用營(yíng)養(yǎng)元素的遺傳潛力，培育養(yǎng)分高效利用的農(nóng)作物新品種，對(duì)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。本研究以26份優(yōu)良普通小麥主栽品種（系）為材料，對(duì)影響小麥成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)、分化和轉(zhuǎn)化的因素進(jìn)行了試驗(yàn)，進(jìn)行了磷高效基因TaPHR1高效表達(dá)載體的構(gòu)建和遺傳轉(zhuǎn)化研究。獲得的主要研究結(jié)果如下：
　　 1、以植物表達(dá)載體pROK2-Ubi為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)帶有酶切位點(diǎn)KpnI和BamHI的一對(duì)引物，從載體pAC25上擴(kuò)增到目的基因TaP

2、HR1。酶切回收后與同樣雙酶切的表達(dá)載體pROK2-Ubi連接，獲得新的高效表達(dá)載體pTaPHR1，并用凍融法將其導(dǎo)入根瘤農(nóng)桿菌LB4404菌株；同時(shí)，進(jìn)一步將表達(dá)載體pTaPHR1中的啟動(dòng)子Ubi換為TaPT2，構(gòu)建了表達(dá)載體pTaPHR1-PT2，為農(nóng)桿菌介導(dǎo)的磷高效基因遺傳轉(zhuǎn)化研究奠定了基礎(chǔ)。
　　 2、通過對(duì)小麥成熟胚進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)及分化再生研究，明確了小麥基因型、吸脹時(shí)間、誘愈培養(yǎng)基2，4-D濃度、分化培養(yǎng)基KT濃度

3、等是影響小麥成熟胚愈傷組織形成和分化再生的重要因子。利用剝胚法（embryo-isolated method，EI）誘導(dǎo)小麥成熟胚產(chǎn)生愈傷組織，并進(jìn)行分化再生培養(yǎng)，篩選出了成熟胚出愈率高、愈傷質(zhì)量好、分化成苗率較高的濟(jì)麥22等基因型材料，確定了適宜的吸脹時(shí)間（18h）、誘愈（2 mg·L-12，4-D）、分化（5 mg·L-1KT）條件。
　　 3、試驗(yàn)明確了侵染菌液濃度及侵染時(shí)間、高滲處理中蔗糖濃度、Ca2+離子處理、共培養(yǎng)中

4、濾紙?zhí)幚?、共培養(yǎng)時(shí)間等因素，對(duì)小麥成熟胚愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化效率有較大影響。接種菌液濃度為OD600=0.6，浸染時(shí)間為60min時(shí)，抗性愈組率達(dá)到最大值4.08％；浸染前進(jìn)行蔗糖高滲處理，當(dāng)蔗糖濃度75 g·L-1時(shí)抗性愈組率最高（濟(jì)麥22，2.90％；泰農(nóng)18，2.78％）；侵染后20 mmol/L Ca2+處理，抗性愈組率達(dá)到最高（5.05％）；共培養(yǎng)過程中添加濾紙片可以提高轉(zhuǎn)化效率，抗性愈組率達(dá)到4.29％；共培養(yǎng)3d，可使抗性愈組