鴨疫里默氏桿菌單克隆抗體的制備及快速檢測方法的建立.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、鴨疫里默氏桿菌(Riemerella anatipestifer,RA)是引起鴨傳染性漿膜炎的病原菌,它主要侵害以水禽為主的多種家禽而引起急性或慢性傳染病。發(fā)病病鴨常表現(xiàn)出嗜睡、歪頸、跛行、排黃綠稀糞,眼鼻有漿液性分泌物,隨后出現(xiàn)痙攣、角弓反張等神經(jīng)癥狀。以纖維素性心包炎、肝周炎、氣囊炎、干酪性輸卵管炎和腦膜炎為其病變特征。鴨傳染性漿膜炎病死率高,又可引起鴨生產(chǎn)性能降低,且治療費用較高,可造成較高的經(jīng)濟損失。因此如何準確、快速的診斷成為

2、防治該病的關鍵。本研究利用全菌免疫法研制了針對鴨疫里默氏桿菌單克隆抗體,并建立了檢測鴨疫里默氏桿菌的雙抗體夾心ELISA方法、免疫膠體金方法和PCR檢測方法,為該病的快速檢測和疾病控制提供了有力的技術支撐。
   1、鴨疫里默氏桿菌單克隆抗體的制備
   本研究利用RA全菌作為免疫原,用弗氏完全佐劑乳化后皮下多點注射免疫BALB/c小鼠,2周、4周后以相同方法使用弗氏不完全佐劑乳化的抗原再各免疫一次;6周后不加佐劑,取相

3、同劑量抗原腹腔注射小鼠,最后一次免疫3天后取免疫鼠脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞融合,獲得RA單克隆抗體雜交瘤細胞株共四株,分別命名為2F7、3C9、5G7和2E6。單抗2F7的亞類為IgG2b,單抗2E6、5G7、3C9為IgG3。這四種單抗與鴨源巴氏桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌無交叉反應,具有良好的特異性,其中單抗5G7與已知血清型1、2、3、11型RA菌株反應,其他3株只與1、2、3型RA株反應。Western-blot結(jié)果顯示單抗5G

4、7可結(jié)合45KD左右蛋白條帶。
   2、鴨疫里默氏桿菌快速檢測方法的建立
   用血清1型RA菌株免疫兔制備RA的多抗血清,純化單抗及多抗血清,用于建立雙夾心ELISA。其中用多抗作為捕獲抗體,單抗作為檢測抗體,用184ng/孔純化的多抗包被過夜;封閉液選擇10%小牛血清37℃封閉2h;檢測抗原、多抗、酶標抗體37℃作用1h;顯色20min后用終止液終止,讀取OD450,讀值高于0.330且P/N>2.1,判定為陽性。

5、所建立的雙抗體ELISA方法與禽源巴氏桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌無交叉反應,模擬樣品的最低檢測劑量為104CFU。以單抗5G7研制的免疫膠體金試紙條有良好的特異性,均不與巴氏桿菌、大腸桿菌和沙門氏菌反應,與四個型的RA都反應。模擬樣品的最低檢出劑量為6×103CFU。根據(jù)16srDNA序列設計引物,擴增出384 bp的目的條帶,以此建立快速PCR的檢測方法,該方法同樣具有較好的特異性,與鴨源巴氏桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌都不反應,而四種血清

6、型的RA均可擴增出相應條帶。模擬樣品的最低檢出細菌濃度200CFU,最低檢測RADNA含量20pg。在臨床病料樣品檢測的結(jié)果顯示PCR、雙抗體夾心ELISA、免疫膠體金檢測方法與傳統(tǒng)細菌分離方法的陽性檢出率分別為40.7%(11/27)、55.6%(15/27)、51.9%(14/27)、40.7%(11/27)。與細菌分離方法相比,三種方法的符合率分別為PCR92.6%、膠體金試紙法88.9%、雙抗體夾心ELISA法為85.2%。因此

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