鴨疫里默氏桿菌轉(zhuǎn)座子突變庫(kù)的構(gòu)建以及生物被膜形成相關(guān)基因的篩選.pdf

1、鴨疫里默氏桿菌病是由鴨疫里默氏桿菌(Riemerella anatipestifer，RA)引起的鴨、鵝、火雞及其它鳥類的一種高致病性、接觸性傳染病，給養(yǎng)鴨業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，是目前危害養(yǎng)鴨業(yè)最為嚴(yán)重的傳染病之一。目前RA基因組序列已在Genbank中公布，預(yù)測(cè)編碼基因超過2000個(gè)，但目前已知功能基因只有少數(shù)。大規(guī)模突變庫(kù)構(gòu)建成為高通量研究RA基因功能的主要工具。
　　 本研究主要通過轉(zhuǎn)座子隨機(jī)插入突變的方法，構(gòu)建RA突變庫(kù)

2、，然后從基因水平上鑒定與鴨疫里默氏桿菌生物被膜形成有關(guān)的基因。主要內(nèi)容為通過結(jié)合轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法將含轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒Tn-x的大腸桿菌BW19851與本實(shí)驗(yàn)室分離保存的RA CH3進(jìn)行接合轉(zhuǎn)導(dǎo)，使轉(zhuǎn)座子Tn-X隨機(jī)插入CH3基因組，以Tn-X上的紅霉素抗性進(jìn)行陽(yáng)性結(jié)合子的篩選，構(gòu)建了一個(gè)包含2000株細(xì)菌的隨機(jī)突變株文庫(kù)，并最終計(jì)算轉(zhuǎn)導(dǎo)效率約為4×10-6。
　　 對(duì)突變株文庫(kù)進(jìn)行生物被膜減少株的篩選，共獲得了生物被膜典型減少株38株，其生

3、物被膜的減少率呈現(xiàn)在40％-100％范圍內(nèi)，推測(cè)這些被阻斷的基因可能在生物被膜形成過程的不同時(shí)期參與作用，從而使相應(yīng)突變株的生物被膜減少率呈現(xiàn)在不同范圍內(nèi)。其中生物被膜減少率達(dá)99％以上的突變株有五株。通過Genome walking等技術(shù)進(jìn)行插入位點(diǎn)的序列測(cè)定，最終成功鑒定出相關(guān)的插入位點(diǎn)。在所有鑒定出的插入位點(diǎn)中有四個(gè)基因至少重復(fù)出現(xiàn)2次，推測(cè)這幾個(gè)基因?qū)ι锉荒さ男纬善鹬匾淖饔谩outhern blot檢測(cè)轉(zhuǎn)座子Tn-X在基