鴨疫里默氏桿菌轉(zhuǎn)座子突變庫的構(gòu)建以及生物被膜形成相關(guān)基因的篩選.pdf

1、鴨疫里默氏桿菌病是由鴨疫里默氏桿菌(Riemerella anatipestifer，RA)引起的鴨、鵝、火雞及其它鳥類的一種高致病性、接觸性傳染病，給養(yǎng)鴨業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失，是目前危害養(yǎng)鴨業(yè)最為嚴重的傳染病之一。目前RA基因組序列已在Genbank中公布，預測編碼基因超過2000個，但目前已知功能基因只有少數(shù)。大規(guī)模突變庫構(gòu)建成為高通量研究RA基因功能的主要工具。
　　 本研究主要通過轉(zhuǎn)座子隨機插入突變的方法，構(gòu)建RA突變庫

2、，然后從基因水平上鑒定與鴨疫里默氏桿菌生物被膜形成有關(guān)的基因。主要內(nèi)容為通過結(jié)合轉(zhuǎn)導的方法將含轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒Tn-x的大腸桿菌BW19851與本實驗室分離保存的RA CH3進行接合轉(zhuǎn)導，使轉(zhuǎn)座子Tn-X隨機插入CH3基因組，以Tn-X上的紅霉素抗性進行陽性結(jié)合子的篩選，構(gòu)建了一個包含2000株細菌的隨機突變株文庫，并最終計算轉(zhuǎn)導效率約為4×10-6。
　　 對突變株文庫進行生物被膜減少株的篩選，共獲得了生物被膜典型減少株38株，其生

3、物被膜的減少率呈現(xiàn)在40％-100％范圍內(nèi)，推測這些被阻斷的基因可能在生物被膜形成過程的不同時期參與作用，從而使相應突變株的生物被膜減少率呈現(xiàn)在不同范圍內(nèi)。其中生物被膜減少率達99％以上的突變株有五株。通過Genome walking等技術(shù)進行插入位點的序列測定，最終成功鑒定出相關(guān)的插入位點。在所有鑒定出的插入位點中有四個基因至少重復出現(xiàn)2次，推測這幾個基因?qū)ι锉荒さ男纬善鹬匾淖饔?。Southern blot檢測轉(zhuǎn)座子Tn-X在基