柑橘果實特異基因CsPMEI啟動子轉(zhuǎn)化番茄的研究.pdf

1、果實特異啟動子對于利用植物基因工程改良果實品質(zhì)性狀至關(guān)重要。分離柑橘果實特異性啟動子并分析其功能對研究柑橘果實成熟的分子機制以及利用生物技術(shù)提高果實品質(zhì)均有重要的意義。目前還尚未有分離獲得柑橘果實特異啟動子的報道,本研究在前期利用Genome Walking技術(shù)分離了柑橘果實特異基因CsPMEI的5’上游1137bp啟動子區(qū)域及構(gòu)建了分別包含三個不同啟動子功能區(qū)域驅(qū)動intron-GUS的雙元表達載體的基礎(chǔ)上,建立了適于Micro-To

2、m番茄的GUS組織化學(xué)染色體系,利用瞬時表達技術(shù)初步分析了不同啟動子區(qū)域驅(qū)動 GUS基因在番茄各組織器官中的表達調(diào)控,通過優(yōu)化Micro-Tom番茄潮霉素遺傳轉(zhuǎn)化體系,并成功獲得轉(zhuǎn)化待測啟動子的轉(zhuǎn)基因番茄植株,通過 GUS染色進一步鑒定該啟動子的功能。主要研究結(jié)果概括如下:
　　(1)GUS染色體系的建立
　　為消除Micro-Tom番茄各組織器官本身內(nèi)源GUS活性對GUS染色結(jié)果的干擾,本研究通過篩選不同pH值的磷酸緩沖液

3、處理外植體,確定最適緩沖液pH為7.2。
　　(2)瞬時表達初步分析目標啟動子功能
　　利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時表達法將不同目標啟動子區(qū)域驅(qū)動 GUS基因轉(zhuǎn)化Micro-Tom番茄的各組織器官,初步分析不同啟動子區(qū)域的表達調(diào)控。根據(jù)染色結(jié)果初步判斷,CsPMEI啟動子-334~-1137區(qū)域具有果實特異性調(diào)控功能,這一結(jié)果有待于通過穩(wěn)定表達分析進一步驗證。
　　(3)優(yōu)化Micro-Tom番茄抗潮霉素的遺傳轉(zhuǎn)化體系。

4、>　　通過篩選潮霉素濃度,試優(yōu)化了Micro-Tom番茄抗潮霉素的遺傳轉(zhuǎn)化體系。以苗齡10d的 Micro-Tom番茄子葉和下胚軸為外植體,農(nóng)桿菌侵染濃度為0.1(OD600),浸染時間為15min,共培養(yǎng)36h后外植體轉(zhuǎn)移至潮霉素濃度為10mg.L-1的培養(yǎng)基中進行篩選,最終獲得18株抗性植株,轉(zhuǎn)化率為10.8％。
　　(4)穩(wěn)定表達鑒定目標啟動子功能
　　利用PCR技術(shù)對抗性植株進行檢測,結(jié)果18株抗性植株均有目的條帶擴