葡萄過氧化氫酶基因在畢赤酵母中的表達及酶學特性的初級研究.pdf

1、過氧化氫酶(Hydrogen peroxidase)，又稱觸酶(Catalase，簡稱CAT)，是一類廣泛存在于動物、植物和微生物體內的末端氧化酶，是以過氧化氫為底物，通過催化一對電子的轉移而將其分解為水和氧氣。在植物中CAT清除光呼吸、線粒體電子傳遞及脂肪酸β-氧化等過程中產生的H2O2。大量研究表明，CAT在植物防御、脅迫應答、延緩衰老及控制細胞的氧化還原平衡等方面起重要作用。成功構建了葡萄過氧化氫酶(VvCAT)的表達質粒，在畢赤

2、酵母中表達并得到純化的過氧化氫酶，從而進一步研究過氧化氫酶的酶學特性，可以為該酶在植物新陳代謝的生理功能提供了研究基礎。
　　 本研究通過重疊延伸PCR技術消除VvCAT基因內部的BamHI切點，根據畢赤酵母密碼子的偏好性進行改造。為了進一步研究VvCAT蛋白的酶學特性，通過電擊轉化法將帶有目的基因的重組質粒表達載體轉化畢赤酵母，添加了AOX1啟動子使其在畢赤酵母中進行甲醇誘導分泌表達。對表達的葡萄過氧化氫酶使用6×His與鎳柱

3、結合的方法進行純化與蛋白定量，通過對其進行SDS-PAGE電泳，得到葡萄過氧化氫酶的分子量為55 KD左右。對VvCAT進行酶學性質分析，得到其對于底物H2O2的最適反應溫度與pH值分別為40℃和9.0，在30℃是溫度穩(wěn)定性最高，對堿性范圍內的緩沖環(huán)境具有良好的穩(wěn)定性，對金屬離子Mn2+高度敏感產生抑制作用，K+、Al3+可以提高酶的活性。葡萄的過氧化氫酶對于底物過氧化氫的酶反應動力學常數Km值為4.806mmol/L，Vmax為102