小麥CBL基因和CIPK基因的克隆及在非生物脅迫中的功能研究.pdf

1、小麥是世界上最重要的糧食作物,其種植面積、總產量及總貿易額均居糧食作物之首。干旱、高鹽等是嚴重影響小麥產量和品質的非生物逆境,研究小麥對逆境信號的感知、傳導以及抗逆性的分子機制,對小麥抗逆分子育種研究與開發(fā)具有重要意義。Ca2+作為第二信使介導植物對各種不同逆境脅迫的反應,這其中涉及到復雜的信號轉導途徑。類鈣調磷酸酶B蛋白(CalcineurinB-Like,CBL)和其互作蛋白激酶(CBL-interactingproteinkina

2、se,CIPK)是與非生物逆境脅迫相關的Ca2+信號轉導中很重要的組分。然而到目前為止,除了發(fā)現(xiàn)一個小麥CIPK基因(WPK4)參與細胞分裂素以及光和營養(yǎng)脅迫信號轉導外,對小麥CBL和CIPK基因的系統(tǒng)研究還未見報道。我們在對DFCI數(shù)據庫和NCBI數(shù)據庫中小麥CBL和CIPK基因相關EST序列的搜索和分析的基礎上,利用RACE技術分別成功地克隆了7個CBL基因和8個CIPK基因,并對它們編碼的蛋白質進行了系統(tǒng)的分析。利用酵母雙雜交方法

3、研究了CBL和CIPK之間特異的相互作用。利用RT-PCR和qRT-PCR技術分析了這些基因在不同非生物脅迫逆境處理下的表達水平。另外,進一步通過對轉TaCIPK14基因和轉TaCIPK29基因的煙草在非生物脅迫下的表型,生理生化指標與分子機制的分析,揭示了TaCIPK14和TaCIPK29在非生物脅迫中功能和作用機理,取得的主要研究結果如下:
　　1)小麥CBL和CIPK蛋白與水稻同源的CBL和CIPK蛋白的氨基酸序列和結構高度

4、相似,這些CBL蛋白均含有四個能結合Ca2+的EF-hands結構域和一個FPSF結構域;CIPK蛋白都含有激酶結構域,FISL結構域和PPI結構域。進化分析顯示,小麥CBL蛋白和CIPK蛋白和水稻同源CBL蛋白和CIPK蛋白都歸類于相同的亞族。
　　2)基因表達分析結果表明,小麥特定的CBL或CIPK基因對冷、鹽、滲透脅迫和ABA處理的響應模式不同,而且同一處理能夠被不同的CBL或CIPK基因感應,這說明小麥CBL和CIPK基因

5、可能介導對不同脅迫信號的交聯(lián)過程。
　　3)利用酵母雙雜交技術分析發(fā)現(xiàn),小麥不同的CBL和CIPK蛋白之間的相互作用的特異性和強度不同。一些重要的特異性的CBL-CIPK互作子如:TaCBL1-TaCIPK9,TaCBL1-TaCIPK23,TaCBL2-TaCIPK2,TaCBL3-TaCIPK2,TaCBL2-TaCIPK29和TaCBL3-TaCIPK29可能參與小麥對不同非生物脅迫的響應。這些結果表明,小麥CBL和CIPK

6、對不同非生物脅迫的信號轉導是通過形成不同的CBL-CIPK復合物來解碼特定脅迫下產生的特異Ca2+信號。
　　4)系統(tǒng)分析了TaCIPK14基因和TaCIPK29基因在非生物脅迫反應中的作用。TaCIPK14基因受冷、滲透脅迫和鹽脅迫等非生物脅迫以及脅迫相關信號分子ABA、乙烯和H2O2誘導。證明了在煙草中過表達TaCIPK14基因可提高轉基因煙草植株對冷和鹽脅迫的抗性。TaCIPK14提高對冷和鹽的抗性是通過調控一些抗氧化酶或脅

7、迫相關基因如NtCAT,NtDREB3和NtLEA等的表達來實現(xiàn)的。增強的抗氧化酶的活性有助于清除逆境下產生的過量ROS,減輕ROS對細胞膜的損傷。同時,TaCIPK14能降低轉基因煙草在鹽脅迫下的Na+含量和提高細胞的K+/Na+比率,這也有助于植物對鹽脅迫的抗性。
　　5)TaCIPK29基因能夠被鹽、冷、甲基紫晶(MV)、ABA和乙烯誘導。過表達TaCIPK29基因的煙草植株增強了對鹽脅迫的抗性。TaCIPK29通過提高一些

8、通道蛋白基因如NtSOS1,NtNHX2,NtNHX4和NtCAX3的表達來維持高的K+/Na+比和Ca2+含量以及通過增強CAT和POD的表達和活性來減少H2O2對細胞膜的損傷來抵抗鹽脅迫的傷害。TaCIPK29沒有特定的定位信號,在整個細胞中都有分布。TaCIPK29不僅能夠特異地與小麥的TaCBL2和TaCBL3互作,也能與煙草的NtCBL2和NtCBL3互作,說明TaCIPK29通過CBL2和CBL3傳遞Ca2+信號。同時TaC

9、IPK29還能與煙草的NtCAT1相互作用,增強其活性,這有助于清除過多的H2O2。因此,TaCIPK29是一個鹽脅迫中的正調控因子,參與了鹽脅迫下對離子和ROS的調控。
　　綜上所述,如同水稻和擬南芥中同源的CBL和CIPK基因一樣,小麥CBL和CIPK基因也是非生物脅迫響應基因。不同的CBL和CIPK基因可能賦予植物對不同逆境的抗性。已鑒定的抗逆基因TaCIPK14和TaCIPK29可作為培育轉基因抗逆小麥新品種的候選基因。本