二花臉豬皮下與肌內脂肪組織基因表達譜比較及脂肪差異沉積調控機制初探.pdf

1、豬肌內脂肪的沉積是一個復雜的生理過程。由于長期追求高瘦肉率低背膘厚的育種目的，使得肌內脂肪含量的下降。提高肌內脂肪含量，同時不影響其它部位脂肪的沉積成為豬育種的一個重要目標。機體的脂肪組織被限定在特定的部位，并且不同部位的脂肪在脂肪前體細胞分化與脂肪代謝能力上存在著差異，這為尋找調控脂肪在不同組織差異沉積的分子機理提供了可能性。為了解皮下脂肪與肌內月旨肪差異沉積的分子機制，我們首先通過基因芯片對皮下脂肪與肌內脂肪的基因表達譜進行比較研究

2、，在此基礎上選擇在兩種組織差異表達、且對脂肪分化與沉積起關鍵調控作用的PPARγ基因為研究對象，從miRNA表觀調控、肌肉分泌因子調控以及核受體共激活因子影響等角度，進一步分析組織間PPARγ表達差異的分子調控機制。
　　主要實驗結果如下:
　　1、利用Affymetrix表達譜芯片對7月齡二花臉豬胸腰接合處的皮下脂旨肪組織與背最長肌中肌內脂肪組織的mRNA表達水平進行了檢測。結果顯示有1228個基因在皮下脂肪中高表達，有9

3、65個基因在肌內脂肪中高表達。通過GO和KEGG分析，發(fā)現(xiàn)皮下脂肪組織在脂肪代謝與脂肪酸代謝方面強于肌內脂肪組織。結果顯示:脂肪分化與沉積的關鍵基因PPARγ與C/EBPα的差異表達是導致兩種脂肪組織代謝與脂肪沉積差異的重要原因，同時發(fā)現(xiàn)ANGPTL4、NNAT、NOR-1和CLIC5基因可能也參與了兩種組織間脂肪差異沉積的調控。
　　2、利用I型膠原酶從新生豬背最長肌中分離出肌內脂肪細胞，并通過“天花板”培養(yǎng)法獲得了肌內脂肪去分

4、化后的后代細胞。這類成纖維狀后代細胞在體外經成脂誘導后可以發(fā)生再分化，表現(xiàn)為細胞質中聚集脂肪滴，并高表達生脂相關基因。通過該技術可以穩(wěn)定地獲得豬肌內脂肪細胞去分化的細胞(dedifferentiatedfatcells，DFAT細胞)，并且DFAT細胞可作為肌內脂肪分化與代謝研究的細胞模型。
　　3、為了研究脂肪在皮下脂肪與肌內脂肪中差異沉積的分子機理，我們比較了脂肪分化與聚集的關鍵基因PPARγ在這兩種組織中表達的差異。并檢測了

5、靶向PPARγ的miRNA在這兩種組織中的表達量，對差異表達的miRNA，通過雙熒光報告系統(tǒng)進行靶向性驗證。通過在肌內DFAT細胞中超表達miRNA來研究其對肌內脂肪DFAT細胞的成脂分化與脂肪聚集的影響，結果發(fā)現(xiàn)肌內脂肪PPARγ的mRNA與蛋白水平顯著低于其在皮下脂肪中的表達量。在生物信息學預測的靶向PPARγ的miRNA中，miR-128與miR-130a在肌內脂肪中顯著高表達。經實驗驗證發(fā)現(xiàn)，只有miR-130a可以靶向PPAR

6、γ的3'-UTR。在肌內DFAT細胞中超表達miR-130a，可以通過抑制PPARγ的表達來抑制肌內DFAT細胞的成脂分化。結果表明，組織間miR-130a的差異導致了PPARγ在肌內與皮下脂肪中的差異表達，這可能是影響兩種脂肪組織差異沉積的重要因素。
　　4、用含有肌肉組織培養(yǎng)液的誘導液可以顯著抑制肌內DFAT細胞的成脂分化，從而推測肌纖維可以分泌抑制肌內脂肪細胞分化的因子。之前報道肌肉生長抑制素(MSTN)可以影響脂肪細胞的分

7、化，所以我們針對MSTN對肌內DFAT細胞的影響做了進一步研究。用不同濃度的MSTN處理肌內DFAT細胞，檢測其對肌內DFAT細胞增殖與分化的影響。通過對肌內脂肪細胞添加MSTN，檢測其對肌內脂肪脂解能力的影響。通過檢測肌肉組織中MSTNmRNA表達量以及血清中MSTN蛋白含量，分析其與肌內脂肪含量的關系。結果顯示，不同濃度的MSTN對肌內DFAT細胞增殖的作用不同，100ng/ml的MSTN可以促進肌內DFAT細胞的增殖，低于100n

8、g/ml的MSTN則抑制肌內DFAT細胞的增殖。MSTN以濃度依賴的方式抑制肌內DFAT細胞的成脂分化與脂滴聚集。MSTN可以通過抑制脂肪分化關鍵基因C/EBPβ、C/EBPα、PPARγ、SREBP1c的表達來抑制肌內DFAT細胞的成脂分化。通過檢測培養(yǎng)基中甘油的釋放量及脂解關鍵基因的表達來檢測MSTN對肌內脂肪細胞脂解能力的影響，結果顯示MSTN對于成熟的肌內脂肪細胞可以通過抑制ATGL與HSL的表達來抑制脂肪分解。在體實驗發(fā)現(xiàn)MS

9、TN的mRNA表達量與肌內脂肪含量無關，血清中MSTN總蛋白含量與肌內脂肪含量的高低無關。
　　5、作為PPARγ重要的共激活因子，SRC-2通過與PPARγ的協(xié)同作用發(fā)揮對脂肪細胞分化的調控作用。為驗證SRC-2在肌內DFAT細胞分化的作用，我們通過siRNA干擾敲低SRC-2的表達，觀察肌內DFAT細胞的成脂分化能力。同過RT-qPCR與油紅O染色檢測，發(fā)現(xiàn)干擾SRC-2后可以顯著抑制肌內DFAT細胞的成脂分化，并且顯著降低P