草魚三個C1q相關基因的克隆及表達分析.pdf

1、草魚是中國乃至世界最重要的淡水養(yǎng)殖魚類之一,具有悠久的養(yǎng)殖歷史。但草魚養(yǎng)殖病害頻發(fā),草魚呼腸孤病毒所導致的草魚病毒性出血病給養(yǎng)殖產業(yè)帶來了巨大損失。迄今為止,有效預防這種傳染病仍然十分困難,傳統方法有其局限性。通過選育出抗病力強的草魚新品種,再結合已有的預防和治療方式來增強草魚抵抗疾病傳染的能力,不失為一條有效的路徑。補體系統,作為先天性免疫中的一類重要和保守的體系,為機體提供了快速和高效地清除入侵微生物的途徑。C1q是補體經典途徑的目

2、標識別蛋白,除能夠激活補體經典途徑外,還具有參與機體免疫的多種功能。本研究克隆了草魚三個C1q相關基因, C1qB、C1qC以及C1q-like,分析了它們的理化性質、氨基酸結構,比較了它們的同源性,研究它們在草魚不同發(fā)育過程、不同組織及其受草魚呼腸孤病毒感染后的表達情況,取得了如下結果:
　　1.通過同源克隆方式得到草魚C1qB和C1qC基因中間片段,從本實驗室已構建的草魚頭腎均一化文庫中獲得C1q-like基因部分cDNA片段

3、;進而采用RACE技術獲得這3個基因的cDNA全長序列,分別為939bp,916bp,1202bp;分別含有編碼243(729bp),244(732bp),248(744bp)個氨基酸的開放閱讀框,N端分別含有26,23,22個氨基酸信號肽序列。
　　2.BLAST分析發(fā)現,草魚C1qB,C1qC和C1q-like都是較為保守的蛋白家族成員,草魚與斑馬魚的C1qB、C1qC氨基酸序列相似度最高,分別達到67％、71%;草魚C1q-

4、like與斑馬魚C1qtnf5氨基酸序列相似度最高;選取各自基因不同物種的氨基酸序列,通過MEGA5.0軟件,使用NJ方法構建系統進化樹,發(fā)現草魚與其它硬骨魚類的親緣關系最近,這些結果都支持了傳統的進化理論,反應了其實際的親緣關系。
　　3.多序列比對和蛋白功能結構域分析發(fā)現,C1qB、C1qC基因都包含有三個保守的結構域:N-端信號肽,膠原結構域和C-端球狀結構域,且其氨基酸序列中與鏈間及鏈內的二硫鍵結合有關的四個半胱氨酸位點一

5、致,并在不同物種中高度保守。但他們的氨基酸序列一致度并不高,表明他們的功能可能具有一定差異性。C1q-like基因具有與補體C1q高度同源的C-端球狀結構域和與TNF-α相似的THD結構域兩大C1q/TNF家族成員重要結構部分。
　　4.利用實時熒光定量PCR技術檢測健康草魚各組織及使用草魚呼腸孤病毒誘導后3個基因的表達譜,結果顯示:3個基因在所有被檢測組織中均有表達,表明他們可能在草魚體內發(fā)揮廣泛的作用;3個基因均在脾臟、中腎、

6、頭腎等免疫器官內呈現高表達,也體現了其在免疫中起到重要作用。經誘導后,3個基因的大多數組織均出現了在顯著上調的現象,尤其是免疫相關組織多在感染早期出現上調后呈下降趨勢,此外,在皮、腮、腸等粘膜組織中也發(fā)現有參與免疫反應的跡象。分析健康草魚和病毒注射后草魚體內3個基因的表達情況,表明草魚呼腸孤病毒可以影響草魚體內的C1q相關基因的表達情況,從而對機體產生一定的影響。
　　5.為了解C1qB、C1qC和C1q-like基因對草魚的胚胎

7、發(fā)育所起到的作用,通過實時熒光定量PCR技術對其進行檢測顯示:在卵子中均檢測到3個基因的表達,這表明他們可能遺傳于母本;3個基因均在胚胎發(fā)育早期及檢測到表達,表明他們在胚胎發(fā)育過程中具有重要的作用。其中草魚C1qB與C1q-like基因的表達譜較為相似,在胚胎發(fā)育的早期具有較高的表達量,表明他們可能參與到卵子發(fā)生、受精的過程中。
　　通過以上研究結果可見,3種基因均在免疫器官中的表達量較高,且受到草魚呼腸孤病毒誘導后表達量都出現顯