家蠶“明”死卵突變體l-em基因的定位克隆及功能研究.pdf

1、家蠶是一種完全變態(tài)昆蟲,以卵滯育,可以說卵是家蠶生命周期中的第一個發(fā)育階段,蠶卵品質的好壞直接影響到幼蟲、蛹和成蟲的發(fā)育。正常卵通常呈短橢圓形、側面扁平且有輕微凹陷。本課題研究對象“明”死卵突變體(lethaleggof“ming”,l-em)是在實用品種“蘇·菊×明·虎”母本品系“明”的生產和保存過程中發(fā)現的一種死卵突變體,在產卵后一小時左右出現三角形凹陷,表現失水死亡特征;遺傳分析發(fā)現該突變由一對隱性基因控制,純合致死,遵循偽母性遺

2、傳規(guī)律;掃描電鏡觀察突變體卵殼,發(fā)現卵殼表面凹陷處小室的邊緣有明顯的裂紋,卵殼縱斷面中間層亦出現不連續(xù)的裂縫。本研究在對l-em卵突變體遺傳分析及表型觀察的基礎上,采用圖位克隆技術對l-em基因進行了定位克隆,采用qRT-PCR、2-DE、RNAi等技術對候選基因進行表達分析和功能驗證。主要研究結果如下:
　　一、l-em基因的定位
　　選擇l-em卵突變體隱性純合的雄性親本(P1)與p50近交系的雌性親本(P2)雜交,組配

3、F1代群體;F1代雌性個體與雄性親本(P1)回交,同時進行蛾區(qū)內自交分別組配BC1F群體及F2代群體。使用P1、P2和F1篩選了28個連鎖群上具有多態(tài)性的SSR分子標記,并使用BC1F群體確定了l-em基因位于家蠶第十連鎖群;進一步對2287個F2代群體中產死卵的雌性個體檢測,使用13個與l-em基因連鎖的具有多態(tài)性的SSR標記,將l-em基因定位于S65與S82兩個標記之間,相距約360kb,繪制出l-em基因的分子標記遺傳連鎖圖譜;

4、通過與家蠶基因組比對查明該區(qū)域內包含24個基因。
　　二、候選基因的表達模式、基因結構分析和功能驗證
　　通過對24個基因在正常蛾及l(fā)-em卵突變體蛾卵巢內的表達分析,明確了2個差異表達基因BmVMP23和BmEP80為候選基因。BmVMP23基因的表達量在l-em卵突變體的卵巢中出現明顯下調,而在l-em卵突變體的卵巢中則未檢測到BmEP80基因的表達。
　　反向PCR分析測序顯示BmVMP23基因終止密碼子后的第2

5、2個堿基至BmEP80基因ORF的第161個堿基間發(fā)生了突變,導致BmVMP23基因的3′-UTR和BmEP80基因結構的不完整性。
　　對2個候選基因的RNAi試驗表明,經BmEP80基因干擾后的部分雌蛾所產卵發(fā)生明顯的凹陷,且表型與l-em卵突變體所產卵的表型相似,而對BmVMP23基因干擾未見此現象。因而推斷BmEP80基因的突變是導致l-em卵突變體產生的主要原因。
　　三、l-em突變體卵巢組織差異蛋白質分析

6、>　　通過雙向電泳技術對正常個體及l(fā)-em卵突變體的卵巢組織進行蛋白質組學分析,結果顯示BmEP80基因所編碼的BmEP80蛋白從蛹期第九天開始在正常個體卵巢中大量表達,而在l-em卵突變體的卵巢中則未檢測到該蛋白的表達。除了BmEP80蛋白之外的其他蛋白在正常個體和l-em卵突變體之間無明顯差異。進一步說明了BmEP80蛋白的缺失是l-em卵突變體產生的主要原因。
　　四、候選基因BmVMP23的表達調控分析
　　鑒于l-

7、em卵突變體的BmVMP23基因的3′-UTR結構被破壞,而3′-UTR為miRNAs的調控位點,為了分析miRNA對BmVMP23基因的表達調控作用,將BmVMP23基因的3′-UTR序列與家蠶的miRNAs序列比對,發(fā)現了一個與BmVMP23基因的3′-UTR序列匹配度極高的miRNA(bmo-miR-1a-3p)。熒光實時定量檢測該miRNA在正常個體卵巢中表達量較高,且其表達趨勢與BmVMP23基因的表達趨勢相反,而在l-em卵