陸地棉亞紅株(Rs)侯選基因的克隆和功能分析.pdf

1、陸地棉亞紅株(Rs)基因是新發(fā)現(xiàn)的一個棉花遺傳標記基因。亞紅株棉的淡紅葉色介于經典紅株棉和正常綠株棉之間，而開花當天的花瓣顏色較經典紅株棉深。此外，相較經典的紅株棉和正常的綠株棉，亞紅株棉的光合效率更高。明確陸地棉亞紅株突變體中花色素合成調控的關鍵基因，不僅為Rs基因的圖位克隆奠定基礎，還為棉花的高光效育種提供一定的理論依據(jù)。
　　前人將Rs基因初步定位于棉花A基因組的第7號染色體上，與陸地棉經典紅株(R1)基因在D基因組第16號

2、染色體上的座位對應。課題組前期從陸地棉經典紅株植株中克隆了與擬南芥PAP1同源的GhPAP1D基因，并預測GhPAP1D基因是R1基因的候選基因。為探究亞紅株棉中的花色素調控基因，本研究從亞紅株棉中克隆了PAP1的同源基因，并對這些同源基因進行了序列分析、轉基因煙草的功能驗證和基因連鎖分析。
　　主要結果如下:
　　1.陸地棉PAP1同源基因的克隆與序列分析
　　根據(jù)D基因組中GhPAP1D對應區(qū)段的序列，從陸地棉中克

3、隆了另外3個PAP1同源基因，分別命名為:GhPAP1A、GhPAP2A和GhPAP2D。從亞紅株棉和正常綠株棉兩種材料中克隆獲得3個PAP1同源基因的共6個cDNA序列。核苷酸序列比對發(fā)現(xiàn)，GhPAP1A基因的cDNA序列在兩種材料中存在3個堿基的差異，而GhPAP2A和GhPAP2D基因的堿基序列在兩種材料中完全一致。
　　多重序列比對表明陸地棉PAP1同源蛋白（GhPAP1A、GhPAP2A、GhPAP1D和GhPAP2D）

4、和可可、擬南芥、花椰菜等物種中的R2R3-MYB蛋白在R2R3 MYB結構域具有高度的序列保守性。這些MYB蛋白在C端均含有一個第6 MYB亞家族(Sg6)特有的保守基序（KPRPR[T/S]）。
　　對GhPAP1A、GhPAP2A、GhPAP1D和GhPAP2D蛋白與擬南芥次生代謝調控相關的MYB亞家族成員的進化樹構建和檢測分析，發(fā)現(xiàn)陸地棉中這4個PAP1同源蛋白均被分到第6亞組（Sg6），說明這4個同源基因與Sg6亞家族的M

5、YB蛋白基因在進化上是同源的。Sg6亞家族的MYB蛋白參與植物花色素的合成調控，推測GhPAP1A、GhPAP2A、GhPAP1D和GhPAP2D蛋白均屬于Sg6亞家族的R2R3-MYB蛋白，具有調控植物花色素合成的功能。
　　2.PAP1同源基因的異位表達
　　為研究克隆的PAP1同源基因的生物學功能，構建了4個棉花PAP1同源基因序列(GhPAP1A-Rs、GhPAP1A-G、GhPAP2A和GhPAP2D)的超量表達載

6、體并通過農桿菌介導法轉入煙草中。結果發(fā)現(xiàn)，4種PAP1同源基因序列的超量表達均能上調花色素結構基因的表達，進而促進轉基因煙草中花色素的合成和積累。以上結果表明來源于亞紅株和正常綠株的GhPAP1A基因(GhPAP1A-Rs和GhPAP1A-G)，以及GhPAP2A和GhPAP2D基因均能編碼有功能的R2R3-MYB蛋白，促進花色素的合成。
　　3.PAP1同源基因的表達分析
　　為進一步探究棉花PAP1同源基因和亞紅植株中花

7、色素途徑調控的關系，利用定量RT-PCR檢測了亞紅株棉中GhPAP1A、GhPAP2A、GhPAP1D和GhPAP2D基因的相對表達量。結果顯示，在亞紅株棉和綠株棉中GhPAP2A、GhPAP1D和GhPAP2D基因的表達水平均較低且無明顯差異，但是GhPAP1A基因在亞紅株棉中的表達水平有著顯著的升高且遠遠高于在綠株棉中的表達水平。推測GhPAP1A基因可能在亞紅株棉的花色素合成中起著關鍵的調控作用。
　　4.GhPAP1A的啟

8、動子研究
　　為研究GhPAP1A基因與亞紅株棉中花色素合成的關系，分別在亞紅株棉和綠株棉中克隆了GhPAP1A基因ORF上游約2.5kb的啟動子序列(pGhPAP1A)。通過核苷酸序列比對發(fā)現(xiàn)，在亞紅株棉中的pGhPAP1A比在綠株棉中多一段50bp的重復序列。利用亞紅株棉×綠株棉的F2群體檢測了重復序列與亞紅株的連鎖關系。GhPAP1A啟動子區(qū)域的重復序列與亞紅株(Rs)基因完全連鎖，表明GhPAP1A基因是陸地棉亞紅株突變體