17-β雌二醇調控綿羊輸卵管上皮細胞β-防御素1基因表達過程中NF-κB信號通路的研究.pdf

1、動物在自然界生存中會受到各種病菌侵染的威脅，因此動物在長期進化的過程中形成的先天性免疫系統(tǒng)可有效的對抗病原菌的侵染。防御素是一類富含半胱氨酸并廣泛分布于各種動物組織和細胞的內源性陽離子抗菌肽(AMPs)，是先天性免疫系統(tǒng)的重要組成部分。由于防御素具有廣譜的細菌和病毒抗性，可有效對抗病原菌的侵染，但其所具有的細胞毒性會對細胞生長不利，因此對防御素表達調控的研究有著重要的意義。
　　之前的研究表明在綿羊發(fā)情期間，其血液雌激素變化同綿羊

2、生殖器官內SBD1表達呈正相關，說明雌激素可能參與綿羊生殖器官內SBD1的表達調控。進一步研究表明SBD1 mRNA在綿羊輸卵管黏膜層上皮細胞游離面的胞質內表達，而固有層、肌層、結締組織中無表達，因此可進行體外雌激素對綿羊輸卵管上皮細胞內SBD1表達調控機制的研究，以闡明雌激素對綿羊輸卵管上皮細胞中SBD1表達的調控機制。通過RT-qPCR方法檢測不同劑量17-β雌二醇在不同時間段對SBD1表達的影響，證實了SBD1表達量在細胞添加10

3、-8M E2后6h左右達到最高。通過RT-qPCR方法檢測細胞添加10-8M E2后0至10.5 h后細胞內SBD1表達量變化，結果發(fā)現(xiàn)添加E2后SBD1表達量在1.5至10.5h呈現(xiàn)顯著性升高(P＜0.05)，在3.5h為其最高表達量時間點。通過RT-qPCR方法檢測了預孵育GPR30激動劑、ERs抑制劑或PKA、PKC和NF-κ B信號通路關鍵蛋白抑制劑后再添加E2的細胞內SBD1在不同時間段的表達量變化，進一步證明了17-β雌二醇

4、誘導SBD1的表達在前期需要通過GPR30所介導非基因組途徑，且需要PKA、PKC和NF-κB三條信號通路的共同參與，而在后期需要雌激素受體所介導的基因組途徑。
　　實驗通過蛋白質印跡方法、RT-qPCR方法檢測了細胞添加E2后NF-κB信號通路關鍵蛋白和NF-κB基因在不同時間段表達量變化，并通過ChIP方法檢測NF-κB蛋白結合SBD1啟動子比率的變化，闡明了NF-κB信號通路在17-β雌二醇誘導綿羊輸卵管上皮細胞SBD1基因

5、表達中的作用機制:靜息狀態(tài)下的NF-κB同抑制蛋白家族的Iκ B相結合形成無活性復合體游存于細胞胞漿內，加入的E2作為外界刺激因子同GPR30結合并產生一系列的級聯(lián)反應;0.5h后IκB蛋白發(fā)生磷酸化生成p-IκB蛋白，隨后p-IκB蛋白通過泛素化被降解，游離的NF-κB蛋白被轉運至細胞核內，1h后轉運入核的NF-κB蛋白同SBD1啟動子結合并激活SBD1的轉錄;隨著細胞質內I-κB蛋白的降低，細胞不斷新生成I-κB并在外源17-β雌二

6、醇繼續(xù)刺激下發(fā)生磷酸化，但由于高表達SBD1的細胞毒性，細胞通過負反饋調節(jié)終止NF-κB信號通路，進而通過細胞內部磷酸化、脫磷酸化和泛素化使細胞內蛋白回歸穩(wěn)態(tài)。
　　以上實驗結果表明，17-β雌二醇誘導輸卵管上皮細胞中SBD1的表達在前期需要通過GPR30所介導非基因組途徑，且需要PKA、PKC和NF-κB信號通路三條信號通路的共同參與，而在后期需要雌激素受體所介導的基因組途徑。細胞通過蛋白磷酸化、泛素化、p65蛋白核轉運和負反饋